一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。本发明专利技术接头序列中的胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。本发明专利技术用于构建甲基化测序文库的接头序列，巧妙的应用了C3～C21长碳链的化学修饰，应用于单链形成的茎环结构测序接头，与现有的主流建库接头相比，有不易产生接头二聚、无需额外进行双链退火和无需使用酶打开茎环中环状结构的优势，在重亚硫酸盐转化后，在不影响后期PCR扩增的基础上，大大的节省了反应时间和试剂成本。

A method for constructing methylation sequencing library and corresponding sequence and kit

The invention discloses a method for constructing a methylation sequencing library, and a corresponding joint sequence and reagent kit. The cytosine bases in the joint sequence of the invention are methylated. The invention is used to construct the junction sequence of the methylation sequencing library, and ingeniously applies the chemical modification of C3-C21 long carbon chain to the stem-ring structure sequencing joint formed by single chain. Compared with the existing mainstream Library-Building joint, it is not easy to produce junction dimerization, does not need additional double-chain annealing and does not need to use enzymes to open the middle ring of the stem-ring structure. The advantage of the shape structure is that the reaction time and reagent cost are greatly saved after bisulfite conversion without affecting the post-PCR amplification.

【技术实现步骤摘要】
一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种构建甲基化测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。
技术介绍
随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医等领域中得到广泛的应用。在生物发育过程中，一个基因组可以衍生出许多不同类型的表观基因组，它们通过不同的基因组DNA修饰方式构成不同的表观遗传信息，使有不同表型的细胞可以将其表观遗传信息通过复制传递给后代细胞。基因组DNA甲基化作为参与范围最广的表观遗传修饰之一，一直是分子遗传学的研究热点，它通过影响基因的表达和染色体结构变化来参与不同的生长发育调控过程。第二代测序技术能够通过全基因组研究，从而对全基因组范围内的5-加急胞嘧啶(5mC)进行研究。常用的甲基化测序又被划分为富集型和单碱基分辨率的甲基化测序两大类：1)富集型的甲基化测序主要通过与高甲基化区域高度亲和的蛋白和抗体，对基因组DNA进行富集，把富集后的基因组DNA进行常规的建库，包括MeDIP-seq和MBD-seq测序等，其使用的建库试剂和接头都与常规的基因组DNA测序文库构建一致；2)单碱基分辨率的甲基化测序，主要是通过重亚硫酸盐(Bisulfite)转化，把没有被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，再通过后续的PCR反应把原有的胞嘧啶遗传密码改变为胸腺嘧啶，实现对是否被甲基化的胞嘧啶进行很好的分辨，因此涉及到亚硫酸盐转化的甲基化测序文库构建的试剂与普通基因组DNA文库构建对接头和后续PCR用的酶有特殊的要求。甲基化测序文库构建常规流程包括：1)基因组DNA的分离提取及打断；2)检测打断后基因组DNA片段质量；3)基因组DNA片段末端补平；4)基因组DNA片段3’端加A尾；5)基因组DNA片段加甲基化专用接头；6)选择基因组DNA片段大小；7)重亚硫酸盐转化；8)PCR扩增；9)检测基因组DNA文库的质量。甲基化测序文库常用试剂为NEBUltra系列、IlluminaTruseq系列及KapaHyper系列等，甲基化专用接头必须保证接头上的所有胞嘧啶都是经过甲基化修饰的，保证在重亚硫酸盐转化的过程中接头的碱基序列不会产生变化，从而影响后续的测序反应。而建库试剂中的接头主要有三种经典结构，包括平端双链接头(以Thermo公司的建库试剂为代表)、Y型结构双链接头(以Illumina公司的建库试剂为代表)和U型结构单链接头(以NEB公司的建库试剂为代表)。这三种接头的主要优势和弊端分别为，平末端的双链接头效率中等，易形成接头自连；Y型结构双链接头连接效率偏低，制作工艺需要额外添加退火步骤，而且退火前两条单链的浓度及比例常因为定量问题而存在批次间产生比例失衡而不稳定；U型结构单链接头由于为单链结构，天然形成部分双链的茎环结构，无需额外退火，连接效率高，不易产生接头自连，但是需要在文库PCR扩增之前使用酶把U型结构打开，增加实验的步骤及试剂成本。现阶段所有的接头设计序列上仍然受到测序上游公司的制约，而设计出连接效率高、最终文库得率高且步骤简单节省试剂成本的接头，将有利于进一步降低基因组测序文库构建成本，推动基因测序的不断发展。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于构建甲基化测序文库的接头序列，所述接头序列的5’端用磷酸修饰，且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的CGACGCTCTTCCGATC形成双链茎结构，其余碱基形成环状结构；3’端最后一个碱基为T，并以硫代修饰；同时，胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。需要说明的是，本专利技术接头序列中，所述环状结构至少包含2个碱基，其中间还以C3(3个连续碳链)～C21(21个连续碳链)修饰。作为一种优选技术方案，所述环状结构上的碱基为39个，其中间以1～3个C18(18个连续碳链)修饰。作为一种最优选技术方案，所述环状结构由19个碱基+C18+20个碱基构成。本专利技术另一目的是提供一种构建甲基化测序文库的方法，其包括如下步骤：S1、提取样品的基因组DNA，进行DNA分子的打断；S2、将打断的DNA分子进行末端修复和加A；S3、在经过末端修复和加A的DNA分子两端加入所述的接头序列；S4、对加入接头序列的DNA分子进行重亚硫酸盐转化，然后进行扩增，得到甲基化测序文库。作为一种优选技术方案，所述接头序列的浓度为5～20μM。作为一种更优选技术方案，所述接头序列的浓度为15μM。本专利技术还有一个目的是提供一种用于构建甲基化测序文库的接头试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述接头序列。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术中，利用能兼容Illumina测序平台的接头序列，利用互补序列以外游离的核酸序列之间加上特殊的修饰，形成一个具有突出T粘性末端，并形成茎环二级结构的单链经修饰接头，应用于构建甲基化测序文库。(2)本专利技术所描述的用于构建甲基化测序文库的接头，能够通过搭配各大主流的建库试剂盒，包括NEB、Thermo和Kapa公司的建库试剂盒，均能实现高效的连接，最终得到浓度足够高的甲基化文库，完成上机测序和后续的甲基化测序相关的应用，有效实现基因测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。(3)本专利技术所描述的用于构建甲基化测序文库的接头，与现有市面上比较成熟的接头产品相比，具有基本的所有胞嘧啶碱基均经过甲基化修饰，保证在重亚硫酸盐转化过程中不会被转化为U而导致无法正常测序。同时，由于有带T碱基的突出末端，与平末端的双链接头相比，具有不容易产生接头自连的优势；由于是单链带茎环的发夹结构，与一端游离的Y型接头相比，无需额外增加退火的步骤，以及无需承担批次间由于定量不准而导致两条单链其一退火后冗余造成的接头质量差异风险；与U型的接头相比，由于结构上巧妙的以一段修饰组成的茎环结构，无需额外使用酶把环状结构打开，在成本上有很大的优势，而且修饰结构并不会影响后期的PCR反应，在步骤上也可以节省工序和时间。(4)通过使用本专利技术的接头进行文库构建，经不同起始量的测试、不同的物种和样品种类来源、与不同主流建库试剂盒试剂搭配使用，以及上机测序的数据，均表明本专利技术设计的接头能够达到预期的甲基化文库建库和测序的性能要求，不仅在甲基化文库PCR后的片段大小和文库浓度上与行业内标准媲美，所构建的甲基化文库能够能满足基因检测的测序要求，具有广泛应用于各种物种来源的甲基化测序。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。表1在一些实施方案中，本专利技术设计的用于构建甲基化测序文库的接头，接头上所有的胞嘧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述接头序列的5’端用磷酸修饰，且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的GCTCTTCCGATC形成双链茎结构，其余碱基形成环状结构；3’端最后一个碱基为T，并以硫代修饰；同时，所述接头序列中的胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。

【技术特征摘要】
1.一种用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述接头序列的5’端用磷酸修饰，且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的GCTCTTCCGATC形成双链茎结构，其余碱基形成环状结构；3’端最后一个碱基为T，并以硫代修饰；同时，所述接头序列中的胞嘧啶碱基经过甲基化修饰。2.根据权利要求1所述用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构至少包含2个碱基，所述环状结构的中间还以C3～C21修饰。3.根据权利要求2所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构上的碱基为39个。4.根据权利要求2所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构的中间以1～3个C18修饰。5.根据权利要求4所述的用于构建甲基化测序文库的接头序列，其特征在于，所述环状结构的中间以1个C18修饰。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，束文圣，吴胜标，王璋，郝祎琪，
申请(专利权)人：广州微芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44