用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明专利技术巧妙的应用了特异性的基因检测区分霍乱弧菌与其它弧菌属，以及产毒和非产毒的霍乱弧菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明专利技术与现有的主流检测试剂盒相比，本发明专利技术用于检测产毒霍乱弧菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种通过特异性基因对产毒霍乱弧菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
技术介绍
弧菌属是革兰氏阴性菌的一种，属于兼性厌氧型细菌，可通过呼吸和发酵代谢产生能量。弧菌属多存在于水中，其中典型代表性的弧菌种类具有致病性，例如：霍乱弧菌(Vibriocholerae)、肠炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus，又称为副溶血弧菌)及创伤弧菌(Vibriovulnificus、俗称为海洋弧菌)等。霍乱弧菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。霍乱弧菌共分为155个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。自然情况下，霍乱弧菌主要通过污染的水源或饮食食物经口而引起肠道感染，具体临床症状表现为：剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡。主要病理变化均由严重脱水引起，临床可见指纹皱缩，皮下组织及肌肉干瘪。心、肝、脾等脏器均见缩小。内脏浆膜无光泽。肠腔高度扩张、肠内充满泔水样液体，肠粘膜松弛，但粘膜上皮完整，无溃疡。胆囊内充满粘稠胆汁。肾小球及间质的毛细管扩张，肾小管肿胀、变性及坏死。其他脏器也有出血、变性等变化。霍乱弧菌包括两个生物型：古典生物型(classicalbiotype)和埃尔托生物型(EL-Torbiotype)。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来，全球共发生了七次世界性霍乱大流行，造成了人类的大量死亡，前六次病原是古典型霍乱弧菌，第七次病原是埃尔托型霍乱弧菌。霍乱弧菌分泌产生的肠毒素，是一种剧烈的致泄毒素。该毒素作用于肠壁促使肠黏膜细胞极度分泌从而使水和盐过量排出，导致严重脱水虚脱；进而引起代谢性酸中毒和急性肾功能衰竭。由霍乱弧菌引起的腹泻性疾病是引起全球五岁以下儿童死亡的第二大疾病。霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱，埃尔托生物型抵抗力较强，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鲜鱼、贝壳类食物上可存活1～2周。霍乱是一种烈性肠道传染病，发病急、传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。因此，准确快速地检测霍乱弧菌对于制定疾病预防、治疗和控制方案具有重大意义。目前，国内外对霍乱弧菌进行了大量研究，建立了很多有效的检测方法，其中细菌纯培养、生理生化检测、血清学分型及噬菌体分型已广泛应用，但仍然存在耗时、灵敏度低等问题。近年来，分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于霍乱弧菌的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法。具体地，上述方法包括如下步骤：S1、收集样品；S2、提取基因组DNA；S3、检测霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3以及产毒特异性基因gene4；S4、读取扩增Ct值；当所述霍乱弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阳性；当所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阴性。作为一种优选技术方案，所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB(NCBIAccessionNumber：KX894541.1)的检测引物如SEQIDNO:1～2所示：SEQIDNO:1(5'-GGTGATGATCTGGCTCCTGG-3')；SEQIDNO:2(5'-ACCCTTGTTACCGTGACGAC-3')。所述霍乱弧菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQIDNO:3～4所示：SEQIDNO:3：(5'-CCCTCAGCCAGATCTTGAGC-3')(NCBIAccessionNumber：QBJ29380.1)；SEQIDNO:4：(5'-TACAGTGCACGGCGTAAACT-3')(NCBIAccessionNumber：QBJ29381.1)。所述霍乱弧菌属特异性基因gene2(NCBIAccessionNumber：AEA77965.1)的检测引物如SEQIDNO:5～6所示：SEQIDNO:5：(5'-CACTCTATTTGCATGGCCGC-3')；SEQIDNO:6：(5'-TGGCTAAATCTGCGGTGATGT-3')。所述霍乱弧菌属特异性基因gene3(NCBIAccessionNumber：QBJ29687.1)的检测引物如SEQIDNO:7～8所示：SEQIDNO:7：(5'-CCCCAACGCTATTTATGTGCC-3')；SEQIDNO:8：(5'-CATCTTCTACCCGCTCAGCC-3')。所述产毒特异性基因gene4(NCBIAccessionNumber：AKB08108.1)的检测引物如SEQIDNO:9～10所示：SEQIDNO:9：(5'-CTAATGCTGCCAATACGCCG-3')；SEQIDNO:10：(5'-GGATGAGGACTGTATGCCCC-3')。本专利技术另一目的是提供一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过前期对霍乱弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分霍乱弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的霍乱弧菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。(2)本专利技术中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。(3)本专利技术检测方法与市面上其他的检测方法相比，本专利技术的两部分检测策略，能够分步判断霍乱弧菌属和其他弧菌属、产毒和非产毒弧菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒霍乱弧菌，结果更加严谨和准确。(4)本专利技术能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。(5)本专利技术检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、水质抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒霍乱弧菌，操作方便、快速、灵敏。本专利技术检测试剂盒能够应用于水产养殖，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、收集样品；/nS2、提取基因组DNA；/nS3、检测霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及产毒特异性基因gene4；/nS4、读取扩增Ct值；当所述霍乱弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阳性；当所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阴性。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及产毒特异性基因gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述霍乱弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阳性；当所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阴性。


2.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQIDNO:1～2所示。


3.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，喻志红，张新帅，王萌萌，王璋，赵亮，郝祎琪，蒋华，束文圣，
申请(专利权)人：广州微芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44