牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒。所述试剂盒的PCR引物为牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm‑kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列的特异性引物。本发明专利技术通过对单一PCR进行优化后建立了三重PCR，通过优化试验，确定该三重PCR的最佳扩增条件为：94℃10min预变性；94℃1min，58℃50s,72℃1min，循环30次；72℃10min延伸。本发明专利技术提供的试剂盒，可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌单一和混合感染的鉴别诊断。试验结果证明试剂盒具有准确、快速、特异强、灵敏度高的特点，能有效检出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌，具有较好的重复性。

【技术实现步骤摘要】
牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒
本专利技术属于动物疾病检测
，尤其是牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒。
技术介绍
牛呼吸道疾病是养牛生产中的一种重要疾病，其特点为发病率和死亡率均高，给养牛生产带来严重的经济损失，让全世界养牛业都深受其害。牛呼吸道疾病病原复杂，主要由牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌等病原菌引起。牛支原体病常常继发或混合感染牛多杀性巴氏杆菌，从而加重病情，感染牛呼吸急促、流涎、发烧、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血，严重的造成死亡。牛结核分枝杆菌主要是呼吸道传播的慢性消耗性疾病，病牛在初期食欲正常，主要呈现顽固性的咳嗽，后期肺部病变严重时，表现呼吸困难，咳嗽加重，流脓性鼻汁，胸部听诊有干性或湿性特征，有时可听到摩擦音。病畜日渐消瘦，贫血等。在临床和病理解剖情况下，三种疾病病原难以区分，容易混淆，且确诊采用的实验室诊断方法有细菌学检测、病原菌分离培养、生化试验、动物回归试验、免疫学诊断等，但时间长、操作繁琐、准确性低，很难适应临床快速诊断的需要。目前也有关于多种呼吸道病原菌的检测研究，但没有关于牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌这3种病菌的同时检测研究。如公开号为C110016512A的专利公开了一种同时检测三种牛呼吸道病原体的多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法；其中所述的三种牛呼吸道病原体为牛分枝杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌；根据牛分枝杆菌的特异性序列229bp序列、牛支原体的uvrC基因和牛肺炎克雷伯菌的khe基因设计并且合成了3组特异性引物和探针。检测方法包括：建立带牛分枝杆菌、牛支原体和牛肺炎克雷伯菌检测标准曲线；提取待测样品的总DNA，以提取的总DNA为模板进行荧光定量PCR；用得到的Cq值或荧光信号的变化，实现对牛分枝杆菌、牛支原体和牛肺炎克雷伯菌的定性检测，在根据荧光信息后按强度和标准曲线，得出待测样品中所含牛分枝杆菌、牛支原体和牛肺炎克雷伯菌的拷贝数，实现定量检测。该专利的公开的方法虽然实现了牛分枝杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌的定量检测，但是时间长、操作繁琐，不适合用于临床快速诊断的需要。又如公开号为CN108277288A公开的牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒；通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因；多重PCR反应最佳退火温度为54.5℃；最佳循环次数30次；可同时进行三种病原菌的检测；多杀性巴氏杆菌最低检测浓度10-2ng/μL，溶血曼氏杆菌最低检测浓度10-1ng/μL，牛支原体最低检测浓度101ng/μL；构建的特异基因PCR-ELISA检测方法。该专利提供的PCR-ELISA检测方法实现了牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌的快速诊断；但是检测灵敏度较差；而且不能实现牛结核分枝杆菌的检测。牛结核分枝杆菌可引起人畜共患牛结核病。牛结核病被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类疫病。我国目前常用PPD技术检测牛结核分枝杆菌，PPD是一种相当复杂的混合物，包含多种抗原成分；而PPD中很多蛋白成分和其他分枝杆菌及一些无关细菌有交叉反应，特异性较差；而且PPD检测技术工作量大、试验时间长、操作繁琐。因此，同时实现牛结核分枝杆菌和其他牛呼吸道病病原菌的快速、准确检测，对畜牧业的发展、人类健康具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒。牛呼吸道疾病主要由牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌等病原菌引起。本专利技术研究者根据PCR技术原理，分别针对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列设计了特异性引物，建立了检测这三种疾病的快速、准确、简便的三重PCR诊断方法，该三重PCR可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌单一和混合感染的鉴别诊断，能直接或在支原体增菌24小时出结果，单一PCR检测方法与三重PCR检测方法符合率高达100％，这显著地加快了临床样本诊断速度，可望为牛呼吸系统疾病的流行病学调查及诊断提供实用技术，具有推广应用价值。具体是通过以下技术方案实现的：牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，所述试剂盒包括以下引物：牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′牛支原体下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′牛多杀性巴氏杆菌下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′牛结核分枝杆菌上引物:5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′牛结核分枝杆菌下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。优选地，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性质粒模板、DL2000Marker、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、PremixTaq、TE缓冲溶液。优选地，所述试剂盒包括：阳性质粒模板240μL，阴性对照240μL，PremixTaq1mL，牛支原体上下引物各40μL，牛多杀性巴氏杆菌上下引物各40μL，牛结核分枝杆菌上下引物各40μL，DL2000Marker为100μL，10mg/ml蛋白酶K400μL，10％十二烷基硫酸钠2mL，TE缓冲溶液2mL。需要说明的是，TE缓冲溶液是按照常规方法进行配置。优选地，所述阴性对照为ddH2O。优选地，所述阳性质粒模板包括牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的DNA模板。优选地，所述试剂盒的PCR扩增体系为：PremixTaq为50μL，阳性质粒DNA模板12μL，20μM的牛支原体上引物、牛支原体下引物、牛多杀性巴氏杆菌上引物、牛多杀性巴氏杆菌下引物、牛结核分枝杆菌上引物、牛结核分枝杆菌下引物各2μL，ddH2O补足至100μL。优选地，所述试剂盒的扩增程序为：94℃预变性10min；94℃1min，58℃50s,72℃1min，循环30次；72℃10min延伸。优选地，所述试剂盒的扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。优选地，所述电泳检测：在226bp、478bp和638bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的试剂盒，能从牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的混合模板中同时扩增出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌特异性目的条带；且各引物与模板之间没有明显的互相干扰。同时，其它的病原菌魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、放线杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金葡萄球菌的DNA为模板，进行PCR扩增试验时，均未出现目的条带。...

【技术保护点】
1.牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物：/n牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′/n牛支原体下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′/n牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′/n牛多杀性巴氏杆菌下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′/n牛结核分枝杆菌上引物:5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′/n牛结核分枝杆菌下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。/n

【技术特征摘要】
1.牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物：
牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′
牛支原体下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′
牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′
牛多杀性巴氏杆菌下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′
牛结核分枝杆菌上引物:5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′
牛结核分枝杆菌下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。


2.如权利要求1所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性质粒模板、DL2000Marker、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、PremixTaq、TE缓冲溶液。


3.如权利要求1或2所述的检测牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌的三重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：阳性质粒模板240μL，阴性对照240μL，PremixTaq1mL，牛支原体上下引物各40μL，牛多杀性巴氏杆菌上下引物各40μL，牛结核分枝杆菌上下引物各40μL，DL2000Marker为100μL，10mg/ml蛋白酶K400μL，10％十二烷基硫酸钠2mL，TE缓冲溶液2mL。


4.如权利要求2所述的检测牛支原体、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴位珩，余波，姜玲玲，杨莉，张涛，刘镜，孙启跃，徐景峨，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52