【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，具体涉及一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒。
技术介绍
1、自21世纪以来，抗生素耐药已成为全球各个国家面临的医疗难题，并被世界卫生组织列为21世纪人类面临的主要公共卫生威胁之一。
2、随着细菌抗生素耐药问题日趋严峻，监测和了解抗生素耐药性的流行、机制和传播规律是感染控制战略的优先事项。细菌耐药基因(args)的快速和准确的检测，可提高临床上应对细菌耐药事件的能力。目前全基因组测序分析(whole genome sequencing，wgs)是一种快速且准确的args检测方法，但对于大批量样品的长期检测，该方案与聚合酶链反应(pcr)技术相比，检测成本控制较高。pcr方法检测args仍是应用较为广泛的一种方法，通常，针对一株临床分离菌株，根据检测需求，需要检测数十种不同类args，然而，因每一种arg对应的引物退火温度不同，得分多次进行pcr反应，因此，一方面多次扩增将导致检测时效性差，另一方面造成pcr扩增仪的样品孔使用率不高，除此之外，部分args pcr反应非特异性扩增较多，对结果的判断造成干扰。
3、针对上述问题，亟需建立一种通用、特异性强且可覆盖大部分args扩增的pcr反应程序。本专利技术开发了一种适用于大肠杆菌29种args检测的td-pcr反应试剂盒，从退火温度、扩增产物长度、引物碱基数、扩增产物量方面进行分析，通过分析该反应试剂盒在24株鹅源分离的大肠杆菌中29种args的检测结果，并与普通pcr反应试剂盒作比较，为细菌耐药性的研究提供便捷高
技术实现思路
1、本专利技术意在提供一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，以解决现有技术中同时检测多种args时，需分多次进行pcr反应，导致检测时效性差，且易造成pcr扩增仪的样品孔使用率不高，以及因部分args的pcr反应非特异性扩增较多，对结果的判断造成干扰的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1、一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，包含pcr试验通用引物和细菌耐药基因引物，所述试剂盒的td-pcr扩增反应程序包括以下5个阶段：
4、第一阶段的反应参数为：95℃预变性5min；
5、第二阶段的反应参数为：95℃变性10s、55℃退火30s、72℃延伸60s；
6、第三阶段的反应参数为：95℃变性10s、54℃退火30s、72℃延伸60s；
7、第四阶段的反应参数为：95℃变性10s、52℃退火30s、72℃延伸60s；
8、第五阶段的反应参数为：72℃延伸5min。
9、进一步，所述第二阶段共5个循环。
10、进一步，所述第三阶段共5个循环。
11、进一步，所述第四阶段共20个循环。
12、进一步，所述pcr试验通用引物是以大肠杆菌标准菌株k12 mg1655 yeej基因为模板设计合成不同tm值、不同产物长度、不同长度的引物，所述细菌耐药基因引物包括β-内酰胺酶类耐药基因引物、氨基糖苷类耐药基因引物、酰胺醇类耐药基因引物、喹诺酮类耐药基因引物和黏菌素类耐药基因引物。
13、进一步，所述β-内酰胺酶类耐药基因引物包括：
14、bladha：f：5'-aactttcacaggtgtgctgt-3’；
15、blacmy-2：f：5'-atgatgaaaaaatcgttatgc-3’；
16、blatem：f：5'-ataaaattcttgaagacgaaa-3’；
17、blashv：f：5'-cactcaaggatgtattgtg-3’；
18、blactx-m-1g：f：5'-cttccagaataaggaatccc-3’；
19、blactx-m-9g：f：5'-tgaccgtattgggagtttg-3’；
20、blaoxa：f：5'-atatctctactgttgcatctcc-3’。
21、进一步，所述氨基糖苷类耐药基因引物包括：
22、aac(3’)-ia：f：5'-ttacgcagcagcaacgatgt-3’；
23、aac(3’)-ⅱc：f：5'-aaccggtgacctattgatgg-3’；
24、aac(3’)-ⅳ：f：5'-ggccacttggactgatcgag-3’；
25、aac(6’)-ib：f：5'-ttgcgatgctctatgagtggcta-3’；
26、aada1：f：5'-aggtagttggcgtcatcgag-3’；
27、aada2：f：5'-ggtgctaagcgtcattgagc-3’；
28、rmta：f：5'-ctagcgtccatcctttcctc-3’；
29、rmtb：f：5'-acatcaacgatgccctcac-3’。
30、进一步，所述酰胺醇类耐药基因引物包括：
31、cat1：f：5'-cttgtcgccttgcgtataat-3’；
32、cat2：f：5'-aacggcaygatgaacctgaa-3’；
33、cmla：f：5'-cgccacggtgttgttgttat-3’；
34、cmlb：f：5'-actcggcatggacatgtact-3’；
35、for：f：5'-ctgagggtgtcgtcatctac-3’。
36、进一步，所述喹诺酮类耐药基因引物包括：
37、qnra：f：5'-atttctcacgccaggatttg-3’；
38、qnrb：f：5'-gatcgtgaaagccagaaagg-3’；
39、qnrc：f：5'-atttctcacaggcaaact-3’；
40、qnrd：f：5'-ttttcgctaactaactcgc-3’；
41、qnrs：f：5'-acgacattcgtcaactgcaa-3’；
42、qepa：f：5'-gcaggtccagcagcgggtag-3’；
43、oqxa：f：5'-gatcagtcag tgggatagttt-3’
44、oqxb：f：5'-ttctcccccggcgggaagtac-3’。
45、进一步，所述黏菌素类耐药基因引物包括：
46、mcr-1：f：5'-cggtcagtccgtttgttc-3’。
47、综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
48、退火的温度关系到pcr反应的特异性好坏，本专利技术通过将反应程序分为5个阶段，并设置了3个由高到低的退火温度及对应循环数，使得pcr反应在较高温条件下特本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，包含PCR试验通用引物和细菌耐药基因引物，所述试剂盒的TD-PCR扩增反应程序包括以下5个阶段：
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述第二阶段共5个循环。
3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述第三阶段共5个循环。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述第四阶段共20个循环。
5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述PCR试验通用引物是以大肠杆菌标准菌株k12MG1655 yeeJ基因为模板设计合成不同Tm值、不同产物长度、不同长度的引物，所述细菌耐药基因引物包括β-内酰胺酶类耐药基因引物、氨基糖苷类耐药基因引物、酰胺醇类耐药基因引物、喹诺酮类耐药基因引物和黏菌素类耐药基因引物。
6.根据权利要求5所述
7.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述氨基糖苷类耐药基因引物包括：
8.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述酰胺醇类耐药基因引物包括：
9.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述喹诺酮类耐药基因引物包括：
10.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒，其特征在于，所述黏菌素类耐药基因引物包括：
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，其特征在于，包含pcr试验通用引物和细菌耐药基因引物，所述试剂盒的td-pcr扩增反应程序包括以下5个阶段：
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，其特征在于，所述第二阶段共5个循环。
3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，其特征在于，所述第三阶段共5个循环。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，其特征在于，所述第四阶段共20个循环。
5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，其特征在于，所述pcr试验通用引物是以大肠杆菌标准菌株k12mg1655 yeej基因为模板设计合成不同tm值、不同产物长度、不同长度的引物，所述细菌耐药基...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘永，徐景峨，李婷，杨莉，张亚楠，李刚，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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