【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及羊支原体性肺炎rpa快速诊断试剂盒的研制。
技术介绍
1、羊支原体性肺炎又称羊传染性胸膜肺炎，是由支原体引起的以高热、咳嗽、流鼻液、呼吸困难、胸和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，是接触性、高度传染性、高发病率和高死亡率为特点的一种传染病。
2、阴雨连绵，寒冷潮湿气候时间居多，养殖模式改变(放牧变为圈养)，规模化的，引种羊群密集、拥挤等因素，有利于空气一飞沫传染的发生；多发生在山区和草原.主要见于冬季和早春枯草季节。羊只营养缺乏，容易受寒感冒，因而机体抵抗力降低，较易发病，发病后病死率也较高。而在羊的养殖过程中，羊支原体肺炎是最常见的呼吸道疾病之一，严重影响了养羊业的健康发展，长期以来，支原体肺炎没有得到较好的控制，主要原因是该病原可长期存在于动物体内，患病初期没有出现明显的临床症状，难以及时被人发现，当出现明显的临床症状时，表明该病已经较为严重，易造成羊只的死亡。
3、本病检测方法有多种。如病原分离培养、elisa、pcr和荧光pcr检测等检测方法。但病原分离培养条件要求高，生长缓慢，分离困难，elisa、基础pcr和荧光pcr检测需要时间长和仪器昂贵。为了预防和控制本病的发生，需要简便、快速、准确地诊断羊支原体性肺炎方法，而rpa诊断简便、快速、特异强和灵敏高方法，20min就可以检测结果。
技术实现思路
1、本专利技术目的是针对现有技术存在的缺陷，提供羊支原体性肺炎rpa快速诊断试剂盒的研制，能够简便、快速、准确地诊断羊支原体性
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、羊支原体肺炎rpa快速诊断试剂盒，所述试剂盒的制备步骤如下：
4、s1、核酸抽提及cdna模板制备；
5、s2、合成实时荧光rpa引物和探针；所述实时荧光rpa引物的设计与合成方法是：根据vectorntisuite软件分析不同国家和地区分离的山羊支原体基因的保守序列，用primerexpress软件，丝状支原体山羊亚种(mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae)arc相关基因，对基因片段设计引物；
6、s3、建立实时荧光rpa反应体系及程序，
7、s4、建立pcr反应体系及程序。
8、进一步，所述基因片段为318bp。
9、进一步，所述核酸抽提及cdna模板制备具体为将组织病料匀浆并离心，取100μl待检上清液或血清，加1mltrizol试剂，吹打20次，加入200μl氯仿，涡旋振荡30s混匀；12000r/min离心15min；取上层水相，加500μl异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min；12000r/min离心10min；弃上清，沉淀用1mldepc水配制的75％乙醇清洗；7500r/min离心10min；弃上清，沉淀室温干燥10min；加30μl depc水溶解rna沉淀，取11μl rna溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液4μl、dntp 1μl、随机引物1μl、rna酶抑制剂1μl、amv逆转录酶2μl，置pcr仪上42℃反应60min，即得cdna模板；取100μl上清液或体液样本用dna抽提试剂盒说明书要进行病毒dna提取，最后将dna用50μl水溶解，即为模板。
10、进一步，所述组织病料为羊痘病毒、羊口疮病毒和羊口蹄疫病毒。
11、进一步，所述引物的序列为：
12、上游引物：5'-atcatttttaatcccttcaagtagtggaat-3’；
13、下游引物：5'-tactatgagtaattataatatatgcaattgttcc-3’；
14、所述探针的序列为：
15、5'-tcatttgcatcagggttagttaacttaat[fam-dt]a[thf][bhq1-dt]ccaacaagtggtgt[3’-c3 spacer]-3’。
16、进一步，所述实时荧光rpa反应体系及程序的建立步骤如下：
17、s31、建立rpa反应体系，具体为按照基础型核酸扩增试剂盒-rpa法说明书设计单一的rpa体系；
18、s32、优化rpa体系的反应时间，具体为rpa体系加样量不变，以山羊支原体dna作为模板，改变反应时间的数值，按照建立的rpa体系进行rpa检测，反应管加样完成后放到恒温仪中反应，其中反应时间的范围为15min-30min；
19、s33、优化rpa体系的反应温度，具体为rpa体系加样量不变，以山羊支原体dna作为模板，改变反应温度的数值，按照建立的rpa体系进行rpa检测，反应管加样完成后放入恒温仪中反应20min，其中反应温度为38℃-42℃；
20、s34、建立实时荧光rpa反应体系及程序，按照荧光型核酸扩增试剂盒-rpa法说明书，根据优化后的最佳rpa反应条件，建立实时荧光rpa反应体系。
21、进一步，所述实时荧光rpa反应体系为：溶解20μl、正向引物(10μm)2.1μl、反向引物(10μm)2.1μl、荧光探针(10μm)0.6μl、模板dna或cdna4μl、ddh2o 19.2μl，反应条件为：38℃孵育20min。
22、进一步，所述建立pcr反应体系及程序具体为：在pcr薄壁管中，加cdna或dna模板1l、10×taq酶浓缩缓冲液2.5μl、dntp 0.5μl、上游引物0.25μl、下游引物0.25μl、taq酶0.25μl，加水补足总体积至25μl，将pcr管置pcr仪上扩增，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
23、进一步，所述pcr扩增程序为：首先94℃2min；然后94℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；最后72℃3min。
24、本专利技术进一步提供羊支原体肺炎rpa快速诊断试剂盒的应用，该试剂盒用于对羊支原体的临床样品进行快捷速、灵敏、准确的检测。
25、综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
26、本专利技术rpa诊断技术是快速，特异性强和敏感高的诊断方法，可20min检测出结果；便于羊场检测，rpa诊断作早期诊断作预防和治疗。
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1.羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备步骤如下：
2.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述基因片段为318bp。
3.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提及cDNA模板制备具体为将组织病料匀浆并离心，取100μl待检上清液或血清，加1mLTRIzol试剂，吹打20次，加入200μL氯仿，涡旋振荡30s混匀；12000r/min离心15min；取上层水相，加500μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min；12000r/min离心10min；弃上清，沉淀用1mLDEPC水配制的75％乙醇清洗；7500r/min离心10min；弃上清，沉淀室温干燥10min；加30μL DEPC水溶解RNA沉淀，取11μL RNA溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液4μL、dNTP 1μl、随机引物1μl、RNA酶抑制剂1μL、AMV逆转录酶2μl，置PCR仪上42℃反应60min，即得cDNA模板；取100μl上清液或体液样本用DNA抽提试剂盒说明书要进行病毒DNA提取
4.根据权利要求3所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述组织病料为羊痘病毒、羊口疮病毒和羊口蹄疫病毒。
5.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述引物的序列为：
6.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述实时荧光RPA反应体系及程序的建立步骤如下：
7.根据权利要求6所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述实时荧光RPA反应体系为：溶解20μL、正向引物2.1μL、反向引物2.1μL、荧光探针0.6μL、模板DNA或cDNA4μL、ddH2O 19.2μL，反应条件为：38℃孵育20min。
8.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述建立PCR反应体系及程序具体为：在PCR薄壁管中，加cDNA或DNA模板1L、10×Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP 0.5μL、上游引物0.25μL、下游引物0.25μL、Taq酶0.25μL，加水补足总体积至25μL，将PCR管置PCR仪上扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
9.根据权利要求8所述的羊支原体性肺炎RPA快速诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增程序为：首先94℃2min；然后94℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；最后72℃3min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的羊支原体肺炎RPA快速诊断试剂盒的应用，其特征在于，该试剂盒用于对羊支原体的临床样品进行快速、灵敏、准确的检测。
...【技术特征摘要】
1.羊支原体性肺炎rpa快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备步骤如下：
2.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎rpa快速诊断试剂盒，其特征在于，所述基因片段为318bp。
3.根据权利要求1所述的羊支原体性肺炎rpa快速诊断试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提及cdna模板制备具体为将组织病料匀浆并离心，取100μl待检上清液或血清，加1mltrizol试剂，吹打20次，加入200μl氯仿，涡旋振荡30s混匀；12000r/min离心15min；取上层水相，加500μl异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min；12000r/min离心10min；弃上清，沉淀用1mldepc水配制的75％乙醇清洗；7500r/min离心10min；弃上清，沉淀室温干燥10min；加30μl depc水溶解rna沉淀，取11μl rna溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液4μl、dntp 1μl、随机引物1μl、rna酶抑制剂1μl、amv逆转录酶2μl，置pcr仪上42℃反应60min，即得cdna模板；取100μl上清液或体液样本用dna抽提试剂盒说明书要进行病毒dna提取，最后将dna用50μl水溶解，即为模板。
4.根据权利要求3所述的羊支原体性肺炎rpa快速诊断试剂盒，其特征在于，所述组织病料为羊痘病毒、羊口疮病毒和羊口蹄疫病毒。
5.根据权利要求1所述的羊支原体...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，袁聪俐，潘永，李婷，徐景峨，李刚，韩勇，张浩然，顏永群，黄开荣，李道敏，孙启跃，杨粤黔，赵滨，李世春，赵文金，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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