【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种突变型逆转录酶及其应用。
技术介绍
1、mmlv逆转录酶由671个氨基酸组成，是一个功能性单体，由四个亚结构域(手指域、手掌域、拇指域和连接域)和核糖核酸酶h(rnase h)活性结构域组成，其中手指域由第41-124位和第160-192位氨基酸组成，手掌域由第1-40位、第125-159位和第193-275位氨基酸组成，也即第1-275位氨基酸共同组成手指/手掌域。拇指域、连接结构域和rnase h活性结构域分别由第276-361位、第362-496位和第497-671位氨基酸组成。研究表明，位于n末端的手指域、手掌域和拇指域组成rna和dna依赖的dna聚合酶活性结构域，其中手掌域包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸转移所需的催化残基，并形成模板-引物结合位点，手指域和拇指域包含与模板-引物复合物和脱氧核糖核苷酸相互作用的残基，形成核酸结合位点的侧面；位于c末端的rnase h活性结构域特异性降解rna-dna杂合链中的rna链。
2、在mmlv逆转录酶的诸多酶学性质中，热稳定性是影响其应用的重要特性。在以rna为模板合成cdna的过程中，提高反应温度可以减少rna的二级结构以及引物的非特异性结合，但mmlv酶的最适反应温度为37℃，因此需要提高酶的热稳定性。同时，野生型mmlv酶的抑制剂耐受性较低，在体系中存在42.9mm胍盐、2.6mm edta、8.7％v/v甲酰胺、13.1％v/v乙醇、0.035％w/v木聚糖或0.27％w/v果胶时，mmlv酶的活性下降50％，而提高抑制
3、综上，有必要开发一种新型逆转录酶，在改善酶的热稳定性、降低或去除rnase h活性的同时提高mmlv逆转录酶的错配耐受性。
技术实现思路
1、本专利技术主要解决的技术问题是提供一种突变型逆转录酶，提高酶的耐热性以及对引物的错配耐受性，改善在病原微生物检测中的准确度、灵敏度和特异性。
2、其次，本专利技术提供一种突变型逆转录酶的编码基因。
3、再次，本专利技术提供一种包含突变型逆转录酶或其编码基因的生物材料。
4、最后，本专利技术提供一种突变型逆转录酶或其编码基因、生物材料在制备逆转录试剂、常规rt-pcr检测试剂、多重rt-pcr检测试剂、rna测序文库构建试剂、rna测序通用试剂等中的应用。
5、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
6、一种突变型mmlv逆转录酶，与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列(如seq id no：1所示)相比，包含以下突变：
7、突变1：e233r，即第233位的谷氨酸突变为丝氨酸。
8、作为本专利技术一种优选的实施方案，所述突变型mmlv逆转录酶与野生型mmlv逆转录酶具有90％以上的序列同源性。更优选地，具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同源性。
9、作为本专利技术一种优选的实施方案，所述突变型mmlv逆转录酶与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列相比，包含突变1，同时还包含以下突变中的一个或两个：
10、突变2：d524g，即第524位的天冬氨酸突变为甘氨酸；
11、突变3：h204r，即第204位的组氨酸突变为精氨酸。
12、作为本专利技术一种优选的实施方案，所述突变型mmlv逆转录酶还可以与sso7d、pcna融合，或者与蛋白质标签(如his、gst)融合，得到具有改进活性的融合蛋白。
13、一种突变型mmlv逆转录酶的编码基因。
14、作为本专利技术一种优选的实施方案，在不改变编码的突变型mmlv逆转录酶的氨基酸序列的前提下，可以根据宿主细胞对密码子的偏好性进行序列优化。
15、一种包含突变型mmlv逆转录酶或其编码基因的生物材料。
16、作为本专利技术一种优选的实施方案，所述生物材料包括但不限于重组表达载体(如质粒)、基因表达盒、重组菌等。
17、作为本专利技术一种优选的实施方案，所述重组表达载体的制备方法包括：将突变型mmlv逆转录酶的编码基因插入表达载体中，得到重组表达载体。
18、作为本专利技术一种优选的实施方案，所述重组菌的制备方法包括：将包含突变型mmlv逆转录酶的编码基因的重组表达载体转化到宿主菌(如大肠杆菌)中，得到重组菌。
19、具体的，所述重组菌的制备方法包括以下步骤：将重组表达载体转化到大肠杆菌中，培养后筛选出阳性克隆进行发酵，具体为将菌落接种到发酵培养基(lb或2×yt培养基)中，37℃培养至od600为0.6-0.8，加入iptg诱导表达后于16℃过夜培养；收集菌体并破碎(可以采用超声波破碎、弗氏压碎器破碎、玻璃珠破碎等物理破碎法，或者用溶菌酶裂解)，在清液中加入pei以去除核酸，再加入硫酸铵沉淀蛋白，经过柱纯化、透析得到粗酶液。
20、一种突变型mmlv逆转录酶或其编码基因、生物材料的用途，所述用途包括以下一种或多种：
21、a)在逆转录合成cdna中的应用；
22、b)在常规rt-pcr检测中的应用；
23、c)在多重rt-pcr检测中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种突变型MMLV逆转录酶，其特征在于：所述突变型MMLV逆转录酶与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列相比，包含以下突变：
2.根据权利要求1所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于：所述突变型MMLV逆转录酶与野生型MMLV逆转录酶具有90％以上的序列同源性；
3.根据权利要求1所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于：所述突变型MMLV逆转录酶与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列相比，包含突变1，同时还包含以下突变中的一个或两个：
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶的编码基因。
5.一种包含如权利要求1-3中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶、或者如权利要求4所述的编码基因的生物材料。
6.一种如权利要求1-3中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶、或者如权利要求4所述的编码基因、或者如权利要求5所述的生物材料的用途，其特征在于：所述用途包括以下一种或多种：
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述用途包括以下一种或多种：
8.一种逆转录试剂、常规RT-PCR
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于：所述试剂中突变型MMLV逆转录酶与反应缓冲液共同组成反应预混液；
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于：所述反应缓冲液包括但不限于dNTPs、Mg2+、缓冲物质、RNase抑制剂、助溶剂、添加剂中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种突变型mmlv逆转录酶，其特征在于：所述突变型mmlv逆转录酶与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列相比，包含以下突变：
2.根据权利要求1所述的突变型mmlv逆转录酶，其特征在于：所述突变型mmlv逆转录酶与野生型mmlv逆转录酶具有90％以上的序列同源性；
3.根据权利要求1所述的突变型mmlv逆转录酶，其特征在于：所述突变型mmlv逆转录酶与野生型mmlv逆转录酶的氨基酸序列相比，包含突变1，同时还包含以下突变中的一个或两个：
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的突变型mmlv逆转录酶的编码基因。
5.一种包含如权利要求1-3中任一项所述的突变型mmlv逆转录酶、或者如权利要求4所述的编码基因的生物材料。
6.一种如权利要求1-3中任一项所述的突变型...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏喜换，孙瑶，张银，张晓亮，张瑞峰，
申请(专利权)人：郑州玛特瑞斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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