【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高通量测序，具体涉及高通量测序文库构建用反应试剂、文库构建方法。
技术介绍
1、二代测序技术又成为高通量测序或者大规模平行测序，是继sanger法的一代从头测序技术之后基于边合成边测序技术的新一代测序方法，能够同时对上百万甚至数十亿个dna分子进行测序，从而实现大规模、高通量等一代测序技术无法企及的目标。
2、高通量测序技术的操作流程是：1)测序文库的构建；2)文库与芯片接头引物杂交；3)扩增成簇；4)延伸测序；5)数据分析等；其中测序文库的构建首先准备基因组，将dna随机片段化成几百碱基或更短的小片段，或者cfdna无需片段化处理，并在两头加上特定的接头。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，rna片段化之后需反转录成cdna，然后加上接头，或者先将rna反转成cdna，然后再片段化并加上接头。在片段化待测核酸模板的两端添加接头，可通过本领域那些技术人员所已知的多种方法来实现，通常通过以下步骤添加合成的接头：(1)通过物理方式或酶促剪切受关注的dna样本；(2)将所得的dna片段进行钝化和磷酸化；(3)将钝化的dna片段的3’端由一个核苷酸延伸，优选由datp延伸；(4)将所得的dna片段连接到3’端具有dttp延伸的接头。靶dna片段的da加尾防止它们与其他dna片段的分子内或分子间的连接，且从而增加具有预期结构的片段的产率。
3、为了简化文库构建流程，提高文库构建的效率，dna片段的末端修复/钝化和da加尾反应可在一个管内完成，其核心原理是利用常温酶进行末端修复，耐热酶进行da加
4、但是将dna末端修复和da加尾反应的全部组分都放在一个单独小瓶内就需要将多种酶保存在同一buffer体系中，至少包括末端修复用常温聚合酶和磷酸化酶，以及da加尾用耐热聚合酶，这些不同的酶原料的最适(高稳定性)保存条件、反应条件等均存在差异，如何平衡各个酶之间的性能，在保证试剂稳定性的前提下，确认试剂的反应效率，尤其是da加尾的反应效率(其直接决定了整个建库效率)，成为了这类产品需要解决的技术问题。
技术实现思路
1、为了实现上述目的，本专利技术的目的在于提供一种高通量测序文库构建用反应试剂，实现高的稳定性的通式，保持高的反应效率，实现建库流程的简化，利于工业化。
2、同时，本专利技术还在于提供一种文库构建方法，采用本专利技术提供的反应试剂，实现文库构建的简化和高效。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
4、一种高通量测序文库构建用反应试剂，由混合酶与反应buffer体系混合制备而成；其中混合酶包括常温dna聚合酶、多核苷酸激酶、耐热dna聚合酶；反应buffer体系中包括400～550mm的tris-hcl，60～120mm的二价阳离子，300～500mm的一价阳离子，60～100mm多羟基化合物，5～10mm peg 8000，10～20mm三甲胺n-氧化物，80～150mm dtt，6～15mmatp，1.0～2.0mm dntps，5mm～10mm datp；所述反应试剂的ph≤7.2。
5、进一步优选的，所述反应试剂的ph＝6.9～7.2。
6、作为举例说明，本专利技术的实施例中使用的多羟基化合物为松三糖。
7、可选的，所述二价阳离子为mg2+；所述一价阳离子为na+和k+，其中na+和k+的比例为2：1。
8、可选的，所述反应buffer体系中还包括20～30mm非离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂选自triton-x-100、吐温20、np-40中一种或两种混合物。
9、可选的，所述非离子表面活性剂为triton-x-100和吐温20按照质量比2：1的混合物。
10、可选的，所述常温dna聚合酶为t4 dna聚合酶，浓度为3u/μl；所述多核苷酸激酶为t4 pnk，浓度为10u/μl；所述耐热dna聚合酶为taq dna聚合酶，其浓度为5u/μl。
11、可选的，所述反应试剂由以下浓度含量的各组分组成：3u/μl t4 dna聚合酶、10u/μlt4 pnk、5u/μl taq dna聚合酶、450mm tris-hcl、80mm mgcl2、200mm nacl、100mm kcl、80mm松三糖，8mm peg 8000，15mm三甲胺n-氧化物，110mm dtt，10mm atp，1.3mm dntps，5mmdatp，18mm triton-x-100，9mm吐温20。
12、一种高通量测序文库构建方法，包括以下操作步骤：1)取含有dna片段的样品加入上述反应试剂，30～40℃条件下反应20～35min，升高温度至70～75℃，反应15～25min，对dna片段进行末修和da加尾处理，获得第一产物；
13、2)在第一产物中加入接头、连接酶及其反应buffer，混合后进行连接反应。
14、本专利技术高通量测序文库构建用反应试剂，应用于二代测序文库构建的末端修复和da加尾，实现末端修复和da加尾在单管反应体系中以连续的方式进行，中间无需纯化，操作简便，适于工业化应用。本专利技术相比现有技术及市售同类产品具有以下有益效果：
15、本领域已知每种酶具有不同的最佳保存和反应条件，比如一种酶所需的添加剂可能对该组分共混物另一种酶的保存和/或催化活性任一项是有害的，比如盐及其浓度、缓冲系统，混合物的ph等，为了实现本专利技术所提供的能够以单一步骤并且在一个容器内使dna片段有效钝化、磷酸化和da加尾的稳定的共混物，需要大量的试验和创造性配方调整，才能实现不同酶在同一反应体系中的兼容。具体的，在保存稳定性方面，本专利技术所提供的反应试剂中包含的混合酶通常包括t4 dna聚合酶、t4 pnk本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，由混合酶与反应buffer体系混合制备而成；其中混合酶包括常温DNA聚合酶、多核苷酸激酶、耐热DNA聚合酶；反应buffer体系中包括400～550mM的Tris-HCl，60～120mM的二价阳离子，300～500mM的一价阳离子，60～100mM多羟基化合物，5～10mM PEG 8000，10～20mM三甲胺N-氧化物，80～150mM DTT，6～15mM ATP，1.0～2.0mM dNTPs，5mM～10mM dATP；所述反应试剂的pH≤7.2。
2.如权利要求1所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述反应试剂的pH＝6.9～7.2。
3.如权利要求2所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述多羟基化合物为松三糖。
4.如权利要求3所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述二价阳离子为Mg2+；所述一价阳离子为Na+和K+，其中Na+和K+的比例为2：1。
5.如权利要求4所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述反应buffe
6.如权利要求5所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为Triton-x-100和吐温20按照质量比2：1的混合物。
7.如权利要求6所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述常温DNA聚合酶为T4 DNA聚合酶，浓度为3U/μL；所述多核苷酸激酶为T4 PNK，浓度为10U/μL；所述耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，其浓度为5U/μL。
8.如权利要求7所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述反应试剂由以下浓度含量的各组分组成：3U/μL T4 DNA聚合酶、10U/μL T4 PNK、5U/μL Taq DNA聚合酶、450mM Tris-HCl、80mM MgCl2、200mM NaCl、100mM KCl、80mM松三糖，8mM PEG 8000，15mM三甲胺N-氧化物，110mM DTT，10mM ATP，1.3mM dNTPs，5mM dATP，18mM Triton-x-100，9mM吐温20。
9.一种高通量测序文库构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1)取含有DNA片段的样品加入如权利要求1～9任一项所述的反应试剂，30～40℃条件下反应20～35min，升高温度至70～75℃，反应15～25min，对DNA片段进行末修和dA加尾处理，获得第一产物；
10.如权利要求9所述的高通量测序文库构建方法，其特征在于，含有DNA片段的样品中DNA的含量为100pg～60ng。
...【技术特征摘要】
1.一种高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，由混合酶与反应buffer体系混合制备而成；其中混合酶包括常温dna聚合酶、多核苷酸激酶、耐热dna聚合酶；反应buffer体系中包括400～550mm的tris-hcl，60～120mm的二价阳离子，300～500mm的一价阳离子，60～100mm多羟基化合物，5～10mm peg 8000，10～20mm三甲胺n-氧化物，80～150mm dtt，6～15mm atp，1.0～2.0mm dntps，5mm～10mm datp；所述反应试剂的ph≤7.2。
2.如权利要求1所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述反应试剂的ph＝6.9～7.2。
3.如权利要求2所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述多羟基化合物为松三糖。
4.如权利要求3所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述二价阳离子为mg2+；所述一价阳离子为na+和k+，其中na+和k+的比例为2：1。
5.如权利要求4所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述反应buffer体系中还包括20～30mm非离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂选自triton-x-100、吐温20、np-40中一种或两种混合物。
6.如权利要求5所述的高通量测序文库构建用反应试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为t...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚倩，王亚文，张银，张晓亮，张瑞峰，
申请(专利权)人：郑州玛特瑞斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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