【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于功能基因改造，具体涉及一类α-半乳糖苷酶突变体及其应用。
技术介绍
1、半乳糖基-甘油是一种由d-半乳糖基和甘油组成的醇溶性半乳糖苷，存在于许多红藻和海藻类当中。α-d-半乳糖基-甘油和β-d半乳糖基-甘油广泛用于化妆品、保健品、食品和药物。一般，α-d-半乳糖基-甘油有两种对映体形式：红藻糖苷和异红藻苷，在藻细胞中主要发挥抗渗透压等作用，同时具有化学抗氧化、抗炎、免疫调节及清除自由基等作用。研究表明，异红藻苷是红藻的主要光合产物，红藻(海萝和坛紫菜)已被证实含有高浓度的异红藻苷。
2、目前，异红藻苷尚未有化学合成法，主要采用醇提工艺从红藻中获得，但是这种方法存在提取工艺复杂，效率低等问题。
3、利用α-半乳糖苷酶催化甘油和d-半乳糖逆水解反应合成异红藻苷具有原子经济性高、成本低等优点，并且结合蛋白质工程手段提高α-半乳糖苷酶酶活对提高异红藻苷的产量具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术通过定点饱和突变对来源于维生素芽孢杆菌anoxybacillusvitaminiphilus的α-半乳糖苷酶进行理性改造，获得一系列α-半乳糖苷酶突变体，可以作为生物催化剂，催化底物甘油和d-半乳糖逆水解反应，生产异红藻苷，提高异红藻苷的转化率。
2、本专利技术具体技术方案如下：
3、一种α-半乳糖苷酶突变体，在seq id no:1所示的氨基酸序列基础上具有a55、p579、g530、n580突变，4个点位中的一种或几种的原始氨基
4、优选第55位的丙氨酸突变为天冬酰胺、第579位的脯氨酸突变为酪氨酸、第530位的甘氨酸突变为半胱氨酸、第580位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺。本专利技术另一目的在于提供一种dna分子，所述dna分子编码本专利技术所述的α-半乳糖苷酶突变体。
5、本专利技术另一目的在于提供一种α-半乳糖苷酶突变体的表达载体，表达如本专利技术所述的α-半乳糖苷酶突变体。所述表达载体，含有编码本专利技术所述的α-半乳糖苷酶突变体的dna分子。所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
6、所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，可以为大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉，优选大肠杆菌。
7、本专利技术另一目的是提供上述α-半乳糖苷酶突变体、其dna分子或其表达载体在催化合成异红藻苷中的应用。具体为以d-半乳糖和甘油为底物催化合成异红藻苷。
8、本专利技术优点如下：
9、本专利技术以来源于anoxybacillus vitaminiphilus的α-半乳糖苷酶agav(核苷酸序列如seq id no:2所示)为模板，将表面疏水氨基酸突变为亲水氨基酸；将通道亲水氨基酸突变为疏水氨基酸，阻碍水分子进入酶活性口袋以期提高α-半乳糖苷酶的合成活性同时降低其水解活性。本专利技术定义溶剂可及表面积大于70％的氨基酸为表面氨基酸。本专利技术使用计算机软件discovery studio 2019虚拟突变预测突变自由能δg，δg负值的突变体对蛋白质结构稳定性没有负面影响，最终选取突变位点如下：a55和p579，将这两个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸，以期提高蛋白表面结合水分子的能力，减少水分子进入活性口袋。考察各突变体的酶活和合成异红藻苷的相对转化率。此外，利用caverweb2.0分析连接底物进入催化中心的可能通道，通道亲水氨基酸为:g530和n580。对这两个突变点位进行饱和突变，考察个突变体的酶活和合成异红藻苷的相对转化率。结果显示，a55、g530、n580位点的部分突变体具有催化效率高的优良性质，对以d-半乳糖和甘油为底物催化合成异红藻苷的效率提高了1.5-2.0。突变体g530c对异红藻苷的转化率提升幅度最为显著，为原始酶的2倍。本专利技术有利于降低异红藻高合成的成本，提高使用该酶生产异红藻苷的转化效率，大大降低了生产成本，具有重要的应用价值。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于所述突变体在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基础上具有A55N、G530C、P579Y、N580Q突变中的一种或几种。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体。
3.一种α-半乳糖苷酶突变体的表达载体，其特征在于表达权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于表达权利2所述的DNA分子。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
7.根据权利6所述的表达载体，其特征在于所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉。
8.根据权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体、权利要求2所述的DNA分子或权利要求3-7任一项所述的α-半乳糖苷酶突变体的表达载体在催化合成异红藻苷中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于所述突变体在seq id no:1所示的氨基酸序列基础上具有a55n、g530c、p579y、n580q突变中的一种或几种。
2.一种dna分子，其特征在于，所述dna分子编码权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体。
3.一种α-半乳糖苷酶突变体的表达载体，其特征在于表达权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于表达权利2所述的dna分子。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴斌，黄壮壮，高振，王佳玲，储建林，何冰芳，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。