【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，本专利技术涉及一种重组肉毒杆菌毒素及其制备方法。
技术介绍
1、肉毒素(botulinum neurotoxin)全称肉毒杆菌毒素，是由一种肉毒梭状芽胞杆菌分泌产生的神经毒素，根据抗原性，可以将其分成a-g共7个血清型。肉毒杆菌毒素具有强烈的神经毒性，可以在极小的剂量下引起神经麻痹，当人食入含有肉毒杆菌毒素的食物后，潜伏期6h到12d，一般3～4d出现临床症状，患者最终因呼吸衰竭而死亡。肉毒杆菌毒素的毒性很强，相当于氰化钾的一万倍。因此，肉毒素的生产有着严格的要求，难以在普通实验室进行获得。
2、肉毒梭状芽胞杆菌原位提取肉毒杆菌毒素是相对传统的方法，其理论较为成熟。但是由于肉毒梭状芽胞杆菌的发酵需要非常严格的厌氧环境，并且对温度非常敏感。因此，需要专门的发酵设备才能进行规模化生产。另外，由于表达的肉毒杆菌毒素没有携带亲和层析标签，在提取中需要多步纯化步骤才能得到相对纯净的蛋白。而且，由于肉毒杆菌毒素的强毒性，制备流程越长，期间造成意外污染的概率越大。
3、因此，亟需开发一种简便、制备流程短且能够在实验室中获得肉毒素的制备方法。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
2、专利技术人在实验过程中发现，如果采用单一标签纯化，得到最终的物质中可能含有不完整的目标蛋白(在wb实验验证中发现，有不完整的目的蛋白，可能是被某些蛋白酶酶解)，而且很难把不完整的和完整的目标蛋白分离开，使
3、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
4、在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种分离的核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸包括：第一核酸片段、第二核酸片段、第一修饰标签以及第二修饰标签，所述第一核酸片段、第二核酸片段、第一修饰标签以及第二修饰标签相连；其中，所述第一核酸片段编码肉毒杆菌毒素的重链；所述第二核酸片段编码肉毒杆菌毒素的轻链；所述第一修饰标签编码his标签；所述第二修饰标签编码gst标签或编码mbp标签。
5、需要说明的是，本文所述的“第一修饰标签”或“第二修饰标签”是指编码his标签、编码gst标签或编码mbp标签的核苷酸序列。“第一修饰标签”或“第二修饰标签”不仅限于本专利技术所列举的核苷酸序列，还包括其他可以用于编码his标签、gst标签或mbp标签所对应的氨基酸的核苷酸序列。
6、专利技术人经过大量实验发现，当第一修饰标签编码his标签同时第二修饰标签编码gst标签或编码mbp标签时，能使后续得到的重组蛋白肉毒素具有较高的活性和纯度，且具有较高的产量，从而节约了成本。
7、根据本专利技术的实施例，所述分离的核酸还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
8、根据本专利技术的实施例，所述核酸进一步包括第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点。
9、根据本专利技术的实施例，所述第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点相同。
10、根据本专利技术的实施例，所述第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点编码3c酶切位点、编码tev酶切位点、编码thrombin酶切位点、编码fxa酶切位点或编码enterokinase酶切位点。当采用上述的酶切位点时，经相对应的蛋白酶酶切后能够完全去除修饰标签序列，且不会残留本身序列中不存在的氨基酸残基。
11、需要说明的是，本文所述的“第一酶切位点”、“第二酶切位点”和“第三酶切位点”是指编码3c酶切位点、编码tev酶切位点、编码thrombin酶切位点、编码fxa酶切位点或编码enterokinase酶切位点的核苷酸序列。“第一酶切位点”、“第二酶切位点”和“第三酶切位点”不仅限于本专利技术所列举的核苷酸序列，还包括其他可以用于编码3c酶切位点、tev酶切位点、thrombin酶切位点、fxa酶切位点或enterokinase酶切位点所对应的氨基酸的核苷酸序列。
12、根据本专利技术的实施例，所述第一修饰标签编码his标签，所述第二修饰标签编码gst标签，所述第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点编码3c酶切位点或编码thrombin酶切位点。专利技术人经过大量筛选实验发现，当采用上述的组合时，能使后续制备的重组蛋白肉毒素具有较高的活性和纯度。
13、根据本专利技术的实施例，所述第一修饰标签编码his标签，所述第二修饰标签编码mbp标签，所述第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点编码3c酶切位点或编码thrombin酶切位点。专利技术人经过大量筛选实验发现，当采用上述的组合时，能使后续制备的重组蛋白肉毒素具有较高活性和纯度。
14、根据本专利技术的实施例，所述第一修饰标签的5’端与第一酶切位点的3’端相连，所述第一酶切位点的5’端与所述第一核酸片段的3’端相连，所述第一核酸片段的5’端与所述第二酶切位点的3’端相连，所述第二酶切位点的5’端与所述第二核酸片段的3’端相连，所述第二核酸片段的5’端与所述第三酶切位点的3’端相连，所述第三酶切位点的5’端与所述第二修饰标签的3’端相连。
15、根据本专利技术的实施例，所述第一核酸片段具有seq id no:1所示的核苷酸序列。
16、ttaaacgacctttgtattaaagtaaacaactgggatctttttttctcaccatcggaagataatttcacgaatgatctgaataaaggagaggagataacatctgatactaacattgaggcggcagaggagaatatatcattagacctgatacaacagtactatttgactttcaactttgataacgaaccggaaaacatcagtatcgaaaatttgtctagcgacattatcgggcaattagaacttatgccgaacatagagcgttttccaaatgggaaaaaatacgagttggacaagtacaccatgtttcattatctgcgggctcaggagtttgagcatggtaaaagtagaattgcgttaacgaatagcgtaaacgaagctctgcttaacccgtcgcgtgtatataccttctttagcagtgattacgtcaagaaagtgaacaaagcaacggaggctgcaatgttcttgggatgggtcgagcagcttgtgtacgactttacggatgaga本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的核酸，其特征在于，包括：第一核酸片段、第二核酸片段、第一修饰标签以及第二修饰标签，所述第一核酸片段、第二核酸片段、第一修饰标签以及第二修饰标签相连；其中，
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，进一步包括第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点；
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述第一修饰标签编码His标签，所述第二修饰标签编码GST标签，所述第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点编码3C酶切位点或编码Thrombin酶切位点；
4.根据权利要求1～3任一项所述的核酸，其特征在于，所述第一修饰标签的5’端与第一酶切位点的3’端相连，所述第一酶切位点的5’端与所述第一核酸片段的3’端相连，所述第一核酸片段的5’端与所述第二酶切位点的3’端相连，所述第二酶切位点的5’端与所述第二核酸片段的3’端相连，所述第二核酸片段的5’端与所述第三酶切位点的3’端相连，所述第三酶切位点的5’端与所述第二修饰标签的3’端相连。
5.根据权利要求1～4任一项所述的核酸，其特征在于，所述第一核酸片段具有SEQ IDNO:
6.一种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求1～5任一项所述的核酸；
7.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述的核酸或权利要求6所述的载体；
8.一种获得重组蛋白肉毒素的方法，其特征在于，包括：将权利要求7所述的重组细胞在适于蛋白表达的条件下进行培养处理；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理是通过如下方式进行的：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理是通过如下方式进行的：
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理是通过如下方式进行的：
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理是通过如下方式进行的：
13.一种重组蛋白肉毒素，其特征在于，由权利要求8～12任一项所述的方法制备获得。
14.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的核酸、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求13所述的重组蛋白肉毒素。
15.权利要求1～5任一项所述的核酸、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的重组细胞、权利要求13所述的重组蛋白肉毒素或权利要求14所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗疾病。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述疾病包括神经肌肉性疾病，所述疾病的症状包括：痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、偏侧面肌痉挛、眼睑障碍、大脑性瘫痪、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱过度活动症、特发性膀胱过度活动症、盆底失迟缓、肢体痉挛、运动性抽动、原发性手部震颤、头部震颤、逼尿肌-括约肌协同失调、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、多汗症、流涎症、过度胃肠分泌、分泌紊乱、肌肉痉挛引起的疼痛、慢性偏头痛或皮肤病症中的一种或几种。
17.权利要求1～5任一项所述的核酸、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的重组细胞、权利要求13所述的重组蛋白肉毒素或权利要求14所述的组合物在制备试剂中的用途，所述试剂用于干扰分离的神经细胞的神经递质释放或通过干扰机体的神经递质释放而改善机体的相关症状，优选的，所述试剂用于美容。
...【技术特征摘要】
1.一种分离的核酸，其特征在于，包括：第一核酸片段、第二核酸片段、第一修饰标签以及第二修饰标签，所述第一核酸片段、第二核酸片段、第一修饰标签以及第二修饰标签相连；其中，
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，进一步包括第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点；
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述第一修饰标签编码his标签，所述第二修饰标签编码gst标签，所述第一酶切位点、第二酶切位点和第三酶切位点编码3c酶切位点或编码thrombin酶切位点；
4.根据权利要求1～3任一项所述的核酸，其特征在于，所述第一修饰标签的5’端与第一酶切位点的3’端相连，所述第一酶切位点的5’端与所述第一核酸片段的3’端相连，所述第一核酸片段的5’端与所述第二酶切位点的3’端相连，所述第二酶切位点的5’端与所述第二核酸片段的3’端相连，所述第二核酸片段的5’端与所述第三酶切位点的3’端相连，所述第三酶切位点的5’端与所述第二修饰标签的3’端相连。
5.根据权利要求1～4任一项所述的核酸，其特征在于，所述第一核酸片段具有seq idno:1所示的核苷酸序列；
6.一种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求1～5任一项所述的核酸；
7.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述的核酸或权利要求6所述的载体；
8.一种获得重组蛋白肉毒素的方法，其特征在于，包括：将权利要求7所述的重组细胞在适于蛋白表达的条件下进行培养处理；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理是通过如下方式进行的：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理是通过如下方式进...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建船，常青，李鹏程，
申请(专利权)人：兰州恒力生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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