用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明专利技术巧妙的应用了特异性的基因检测区分产气荚膜梭菌与其它梭菌，通过判断，得出准确的菌信息。本发明专利技术与现有的主流检测试剂盒相比，本发明专利技术用于检测产气荚膜梭菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种通过特异性基因对产气荚膜梭菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。产气荚膜梭菌为革兰阳菌粗短大杆菌。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在机体内可产生明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。生长适宜温度为37-47℃，在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。在庖肉培养基中培养数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色。致病条件与全国各地破伤风梭菌相似。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。毒素的毒性虽不如肉毒毒素和破伤风毒素强，但种类多，外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12种，对人致病的主要是a型，引起气性坏疽和食物中毒。C型则引起坏死性肠炎。食品中产气荚膜梭菌的检测，最常使用的还是参照GB4789.13-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》，进行样品制备，培养及试验。近年来，分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用产气荚膜梭菌的检测，此项目乃开发国产基因芯片针对产气荚膜梭菌做高效且高精准度的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法。具体地，上述方法包括如下步骤：S1、收集样品；S2、提取基因组DNA；S3、检测产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；S4、读取扩增Ct值；当所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB中至少1个基因的Ct值均小于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阳性；当所述荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阴性。作为一种优选技术方案，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1(NCBIAccessionNumber：BAB81852.1)的检测引物如SEQIDNO:1～2所示：SEQIDNO:1(5'-TGGGGTAATTGTTGTGGCACT-3')；SEQIDNO:2(5'-TGTCCACCTACACTTTCAGCC-3')。所述产气荚膜梭菌特异性基因gene2(NCBIAccessionNumber：AXH51720.1)的检测引物如SEQIDNO:3～4所示：SEQIDNO:3(5'-AATAAACTTTGGTGGGAACGGAC-3')；SEQIDNO:4(5'-TTTCCACTACAACCGCCACC-3')；所述产气荚膜梭菌特异性基因gene3(NCBIAccessionNumber：BAB80441.1)的检测引物如SEQIDNO:5～6所示：SEQIDNO:5(5'-TCTGGTTTGGTAGAGCACTTGT-3')；SEQIDNO:6(5'-AGTGCTCCTACGTTACATCCATT-3')。所述产气荚膜梭菌特异性基因gene4(NCBIAccessionNumber：AOY54621.1)的检测引物如SEQIDNO:7～8所示：SEQIDNO:7(5'-TGTATAGTTGCAGCCTTGGGG-3')；SEQIDNO:8(5'-TCTACCACTCTTCGTTGTCCC-3')。所述产气荚膜梭菌特异性基因rpoB(NCBIAccessionNumber：AB055810.1)的检测引物如SEQIDNO:9～10所示：5'-GTCGTCACGGTAACAAAGGG-3'；5'-ACTTGCAGCCCATCCTAAGT-3'本专利技术另一目的是提供一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的检测引物。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过前期对产气荚膜梭菌和其他梭菌微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分产气荚膜梭菌和其他梭菌的特异性的梭菌基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产气荚膜梭菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有特异性。(2)本专利技术中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。(3)本专利技术能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。(4)本专利技术检测方法能够应用于对于环境的水体样品、临床样品、食品抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产气荚膜梭菌，操作方便、快速、灵敏。本专利技术检测试剂盒能够应用于医疗卫生监控，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。附图说明图1是rpoB基因检测引物标准曲线。图2的gene1基因检测引物标准曲线。图3是gene2基因检测引物标准曲线。图4是gene3基因检测引物标准曲线。图5是gene4基因检测引物标准曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。表1在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本专利技术所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出产气荚膜梭菌和其他梭菌，从而准确检测并判断出产气荚膜梭菌。在一些实施方案中，通过对10个、100个、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、收集样品；/nS2、提取基因组DNA；/nS3、检测产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；/nS4、读取扩增Ct值；当所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB中至少1个基因的Ct值均小于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阳性；当所述荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阴性。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；
S4、读取扩增Ct值；当所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB中至少1个基因的Ct值均小于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阳性；当所述荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阴性。


2.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1的检测引物如SEQIDNO:1～2所示。


3.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，吴胜标，谢燕荣，宁大亮，石舟，蒋华，束文圣，
申请(专利权)人：广州微芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44