快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒，其中，该方法包括：提取菌株DNA；将提取菌株DNA及引物置于反应液内进行LAMP扩增反应；所述反应液包含有引导物，所述引物分别为：上游外引物F3：5’‑TGGGGTTATTCTTTCGCT‑3’；下游外引物B3：5’‑TTTCCAAGCTTACTGCAATT‑3’；上游内引物FIP：5’‑CCagCAAAacAGCCTAAATACATTG‑TGGGGAGTATCTTTGAGAGG‑3’；下游内引物BIP：5’‑TTGGGATACTGTGCTATTTTTCTCT‑GGGAAGATGAGAAATACGAGC‑3’；上游环引物LF：5’‑CGCCTCCGTGATGAGGATG‑3’；下游环引物LB：5’‑GCAGAAAAGGGCTAGCGC‑3’；LAMP扩增反应结束后，对反应液进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在。本发明专利技术实施例通过设计2对引物扩增高毒力肺炎克雷伯菌peg‑344基因的6个不同区域，建立一种快速、简便、经济地检测痰液中高毒力肺炎克雷伯菌的方法，且具有较好的特异性特征。

【技术实现步骤摘要】
快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及微生物检测
，尤其涉及一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒。
技术介绍
肺炎克雷伯菌是社区获得性感染和医院获得性感染常见的致病菌。肺炎克雷伯菌具有厚厚的荚膜多糖，可有效地抑制中性粒细胞吞噬及抗生素的作用，从而更容易导致肺炎、血流感染及尿路感染等。当前随着荚膜多糖种类的差异及细菌毒力的变迁，肺炎克雷伯菌高毒力株引起的感染已经成为了一种世界性感染疾病。较医院获得性感染的“经典”肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)，hvKP感染后死亡率高，且伴有脓毒症及迁徙性感染等严重并发症。近年来，hvKP菌耐药性及其与细菌适应性/毒力的关系备受世界关注。尤其是碳青霉烯类耐药hvKP菌(CR-hvKP)的涌现，给临床治疗和基础研究带来了严重的挑战。高毒力肺炎克雷伯菌是一种常见的社区获得性和医院感染病原体，可引起肝脓肿、眼内炎、败血症等播散性感染，多与K1和K2荚膜血清分型及高黏液表型有关，常被定义为高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)。近30多年来研究发现，肺炎克雷伯菌属已逐渐成为细菌性肝脓肿的主要病原体，尤其是以高毒力肺炎克雷伯菌更为常见，并以一种新的侵袭性综合征正在蔓延。hvKP具有很强的侵袭力及生物膜形成能力，所致感染包括腹部疾病(社区获得性肝脓肿、脾脓肿、自发性细性腹膜炎)、胸部疾病(肺炎、脓胸)、眼内炎、中枢神经系统疾病(脑膜炎)、骨骼肌与软组织感染、尿道感染、混合感染、菌血症，其中最常见的是社区获得性肝脓肿。对高毒力肺炎克雷伯菌的检测是判断肝脓肿、眼内炎、败血症等播散性感染致病原因的重要手段。传统检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法包括菌落形态、拉丝试验、线虫试验、中性粒细胞抗吞噬试验、血清抗性试验等,这些方法耗时较长,不能快速报告临床,容易延误病情。此外，传统方法检测灵敏度比较低而且特异性不强，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难通过生理生化的方式加以区分。运用传统PCR(PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应)方法虽然能够快速鉴定细菌,但传统PCR方法所需的设备昂贵,步骤复杂,对人员要求高,不易大面积推广。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新型的、恒温条件下的核酸体外扩增技术，具有等温、快速、高特异性和灵敏度、产物检测简便等特点。该技术由Notomi等在2000年专利技术，现已应用于病毒、真菌等微生物检测和商业基因测序中。其特点是针对选取特异性及稳定性良好的靶标DNA(一般不超过300bp)，设计2对针对靶标DNA6个区域的特异性引物，并利用一种大分子链置换酶(BstDNA聚合酶)，在等温条件下(60～70℃)反应持续30～60min，即可完成核酸体外扩增过程。LAMP方法可在等温环境下遵循环状锁链置换原理，扩增产物在核酸电泳上表现为大小不一、层次分明的阶梯状条带。而针对于高毒力肺炎克雷伯菌的检测，目前普遍还是采用传统PCR方法检测，由于PCR方法所需的设备昂贵,步骤复杂,对人员要求高,不易大面积推广，故需要提供一种更加快速、简单及低成本的检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的第一个目的在于提出一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法。本专利技术的第二个目的在于提出一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测试剂盒。为实现上述目的，第一方面，根据本专利技术实施例的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，包括步骤：提取菌株DNA；将提取菌株DNA及引物置于反应液内进行LAMP扩增反应；所述反应液包含有引导物，所述引物分别为：上游外引物F3：5’-TGGGGTTATTCTTTCGCT-3’；下游外引物B3：5’-TTTCCAAGCTTACTGCAATT-3’；上游内引物FIP：5’-CCagCAAAacAGCCTAAATACATTG-TGGGGAGTATCTTTGAGAGG-3’；下游内引物BIP：5’-TTGGGATACTGTGCTATTTTTCTCT-GGGAAGATGAGAAATACGAGC-3’；上游环引物LF：5’-CGCCTCCGTGATGAGGATG-3’；下游环引物LB：5’-GCAGAAAAGGGCTAGCGC-3’；LAMP扩增反应结束后，对反应液进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在。进一步地，根据本专利技术的一个实施例，所述提取菌株DNA方法包括：将实验细菌接种于MH琼脂平板上，并在培养箱内37℃过夜培养；从MH琼脂平板上刮取适量细菌于500ul的经高压灭菌的双蒸馏水的EP管内，沸水浴10min；在冰箱内冷却10min；在4℃温度环境下，12000g离心10min后取上清液。进一步地，根据本专利技术的一个实施例，所述反应液的混合液配置为：12.5μL2×HNBLAMP混合液；2.5μL10×LAMP引物混合液；0.8M甜菜碱；1.0μLBstDNA聚合酶；1μL模板DNA；25μL无菌水。进一步地，根据本专利技术的一个实施例，所述2.5μL10×LAMP引物混合液浓度配置为：上游外引物F3、下游外引物B3浓度分别为：0.5uM；上游内引物FIP、下游内引物BIP分别浓度为：8uM；上游环引物LF、下游环引物LB分别浓度为：2uM。进一步地，根据本专利技术的一个实施例，LAMP扩增反应的反应条件为：将LAMP扩增反应的混合液置于水浴环境下；反应温度为：55～85℃之间，每5℃一个梯度；反应时间为：40～70min之间，每5min一个梯度。进一步地，根据本专利技术的一个实施例，LAMP扩增反应的反应条件具体为：反应温度为：65℃；反应时间为：60min；终止反应温度为：85℃；终止反应时间为：5min。进一步地，根据本专利技术的一个实施例，所述对反应结果进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在包括：取反应液，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有梯度条带处在，且最小条带为180bp，则说明有高毒力肺炎克雷伯菌存在，否则，则说明没有高毒力肺炎克雷伯菌存在；或者，取反应液加入SYBRgreenI荧光检测，若反应液出现绿色，则说明有高毒力肺炎克雷伯菌存在，否则，则说明没有高毒力肺炎克雷伯菌存在。另一方面，本专利技术还提供一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测试剂盒，包括：LAMP扩增反应液，所述LAMP扩增反应液包含有引物，所述引物分别为：上游外引物F3：5’-TGGGGTTATTCTTTCGCT-3’；下游外引物B3：5’-TTTCCAAGCTTACTGCAATT-3’；上游内引物FIP：5’-CCagCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，包括：/n提取菌株DNA；/n将提取菌株DNA及引物置于反应液内进行LAMP扩增反应；/n所述反应液包含有引导物，所述引物分别为：/n上游外引物F3：5’-TGGGGTTATTCTTTCGCT-3’；/n下游外引物B3：5’-TTTCCAAGCTTACTGCAATT-3’；/n上游内引物FIP：5’/n-CCagCAAAacAGCCTAAATACATTG-TGGGGAGTATCTTTGAGAGG-3’；/n下游内引物BIP：5’/n-TTGGGATACTGTGCTATTTTTCTCT-GGGAAGATGAGAAATACGAGC-3’；/n上游环引物LF：5’-CGCCTCCGTGATGAGGATG-3’；/n下游环引物LB：5’-GCAGAAAAGGGCTAGCGC-3’；/nLAMP扩增反应结束后，对反应液进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，包括：
提取菌株DNA；
将提取菌株DNA及引物置于反应液内进行LAMP扩增反应；
所述反应液包含有引导物，所述引物分别为：
上游外引物F3：5’-TGGGGTTATTCTTTCGCT-3’；
下游外引物B3：5’-TTTCCAAGCTTACTGCAATT-3’；
上游内引物FIP：5’
-CCagCAAAacAGCCTAAATACATTG-TGGGGAGTATCTTTGAGAGG-3’；
下游内引物BIP：5’
-TTGGGATACTGTGCTATTTTTCTCT-GGGAAGATGAGAAATACGAGC-3’；
上游环引物LF：5’-CGCCTCCGTGATGAGGATG-3’；
下游环引物LB：5’-GCAGAAAAGGGCTAGCGC-3’；
LAMP扩增反应结束后，对反应液进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在。


2.根据权利要求1所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述提取菌株DNA方法包括：
将实验细菌接种于MH琼脂平板上，并在培养箱内37℃过夜培养；
从MH琼脂平板上刮取适量细菌于500ul的经高压灭菌的双蒸馏水的EP管内，沸水浴10min；
在冰箱内冷却10min；
在4℃温度环境下，12000g离心10min后取上清液。


3.根据权利要求1所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述反应液的混合液配置为：
12.5μL2×HNBLAMP混合液；
2.5μL10×LAMP引物混合液；
0.8M甜菜碱；
1.0μLBstDNA聚合酶；
1μL模板DNA；
25μL无菌水。


4.根据权利要求3所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述2.5μL10×LAMP引物混合液浓度配置为：
上游外引物F3、下游外引物B3浓度分别为：0.5uM；
上游内引物FIP、下游内引物BIP分别浓度为：8uM；
上游环引物LF、下游环引物LB分别浓度为：2uM。


5.根据权利要求4所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应的反应条件为：
将LAMP扩增反应的混合液置于水浴环境下；
反应温度为：55～85℃之间，每5℃一个梯度；
反应时间为：40～70m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，龙丹，万腊根，孔蕴源，向天新，
申请(专利权)人：刘洋，
类型：发明
国别省市：江西;36