WNT10A制造技术

本发明专利技术涉及

【技术实现步骤摘要】
WNT10A基因功能缺失变异疾病模型犬的建立方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及利用基因编辑技术建立
WNT10A
基因功能缺失变异疾病模型犬的方法
。

技术介绍

[0002]牙齿是口颌面的重要器官，牙齿的正常数目是完成生理功能的基础
。
先天性牙齿缺失
(
以下简称先天缺牙
)
是常见的遗传疾病之一，影响患者的咀嚼
、
发音
、
美观等
。
[0003]人类先天缺牙患者中通过临床遗传学分析发现多种基因的突变与先天缺牙相关
。
其中常见的致病基因变异是
WNT10A(Wingless
‑
type MMTV
整合位点家族，成员
10A)
基因
。
非综合征性多数牙缺失患者
(
先天缺失6颗牙以上
)
中，
WNT10A
突变的携带者频率高达
56
％
。WNT10A
基因突变可以常染色体显性
、
常染色体隐性的遗传方式导致先天缺牙，基因突变的功能影响与缺牙的表现呈现一定的剂量依赖关系
。
[0004]基因敲除小鼠模型是研究牙发育较为常用的实验动物模型
。
但是
WNT10A
基因敲除小鼠并未出现类似人类
WNT10A
突变患者的先天缺牙表现/>。
由于以往牙发育研究多以啮齿类动物为研究模型，没有乳恒牙替换，无法进行人类乳恒牙替换相关研究
。
若要研究
WNT10A
双等位基因功能缺失变异对恒牙发育的影响，基因敲除小鼠模型无法胜任
。
[0005]因此，需要人工创建出
WNT10A
基因编辑犬为
WNT10A
基因功能缺失变异疾病的研究提供优质的动物模型
。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种经基因编辑技术建立
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬的方法
。
本专利技术还涉及所建立的
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬，其细胞和组织
。
[0007]本专利技术的一方面提供了一种
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞
。
[0008]在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自
BE3
单碱基编辑技术
、CRISPR、TALEN
和
ZFN
，优选为
CRISPR/Cas9。
[0009]在一些实施方式中，所述方法包括对
WNT10A
基因的2号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入
、
取代或缺失
。
[0010]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0011](1)
根据犬
WNT10A
基因的2号外显子的序列确定打靶位点；
[0012](2)
根据步骤
(1)
确定的打靶位点合成
sgRNA
序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建
sgRNA
打靶载体；
[0013](3)
通过体外转录，分别获得
sgRNA
和
CRISPR/Cas9
的体外转录产物；
[0014](4)
将步骤
(3)
获得的
sgRNA
和
CRISPR/Cas9
的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞
。
[0015]在一些实施方式中，根据犬
WNT10A
基因的2号外显子的序列确定3条
sgRNA
，
[0016]优选地，所述
sgRNA
的序列及其互补序列包括以下序列：
[0017]sgRNA1
：
GCGGAGGCCCAGAATGTCGTTGG(SEQ ID NO:2)
[0018]sgRNA1
的互补序列：
CCAACGACATTCTGGGCCTCCGC(SEQ ID NO:3)
[0019]sgRNA2
：
CAACGTTAGGCACACCGTGTTGG(SEQ ID NO:4)
[0020]sgRNA2
的互补序列：
CCAACACGGTGTGCCTAACGTTG(SEQ ID NO:5)
[0021]sgRNA3
：
GGCACTCATGGATGGCGATCTGG(SEQ ID NO:6)
[0022]sgRNA3
的互补序列：
CCAGATCGCCATCCATGAGTGCC(SEQ ID NO:7)。
[0023]在一些实施方式中，所述方法还包括将
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬
。
[0024]在另一些实施方式中，所述方法还包括将
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬
。
[0025]在一些实施方式中，所述犬体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织
、
皮肤
、
肌肉
、
耳
、
乳腺
、
输卵管
、
卵巢
、
血液
、
尿液
、
脂肪
、
骨髓
、
血管和管腔内皮
。
[0026]在一些实施方式中，所述犬体细胞选自胎儿成纤维细胞
、
皮肤细胞
、
上皮细胞
、
耳细胞
、
成纤维细胞
、
内皮细胞
、
肌肉细胞
、
乳腺细胞
、
输卵管细胞
、
卵巢细胞
、
卵丘细胞
、
神经细胞和成骨细胞
。
[0027]在一些实施方式中，所述
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬的基因组包含如
SEQ ID NOs:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自
BE3
单碱基编辑技术
、CRISPR、TALEN
和
ZFN
，优选为
CRISPR/Cas9。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括对
WNT10A
基因的2号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入
、
取代或缺失
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)
根据犬
WNT10A
基因的2号外显子的序列确定打靶位点；
(2)
根据步骤
(1)
确定的打靶位点合成
sgRNA
序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建
sgRNA
打靶载体；
(3)
通过体外转录，分别获得
sgRNA
和
CRISPR/Cas9
的体外转录产物；
(4)
将步骤
(3)
获得的
sgRNA
和
CRISPR/Cas9
的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞；优选地，步骤
(1)
中，根据犬
WNT10A
基因的2号外显子的序列确定3条
sgRNA
，更优选地，所述
sgRNA
的序列及其互补序列包括以下序列：
sgRNA1
：
GCGGAGGCCCAGAATGTCGTTGG(SEQ ID NO:2)sgRNA1
的互补序列：
CCAACGACATTCTGGGCCTCCGC(SEQ ID NO:3)sgRNA2
：
CAACGTTAGGCACACCGTGTTGG(SEQ ID NO:4)sgRNA2
的互补序列：
CCAACACGGTGTGCCTAACGTTG(SEQ ID NO:5)sgRNA3
：
GGCACTCATGGATGGCGATCTGG(SEQ ID NO:6)sgRNA3
的互补序列：
CCAGATCGCCATCCATGAGTGCC(SEQ ID NO:7)。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬；或者所述方法还包括将
WNT10A
基因表达降低或缺失的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬
。6.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述
WNT10A
基因缺失功能变异疾病模型犬表达具有如
SEQ ID NOs:11、13、14、15
和
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【专利技术属性】
技术研发人员：米继东，郑敏，刘洋，韩冬，冯海兰，
申请(专利权)人：刘洋，
类型：发明
国别省市：