用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明专利技术巧妙的应用了特异性的基因检测区分生殖支原体与其它原体属，以及产毒和非产毒的生殖支原体属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明专利技术与现有的主流检测试剂盒相比，本发明专利技术用于检测产毒生殖支原体的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种通过特异性基因对产毒生殖支原体进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
技术介绍
支原体是一类比细菌小比病毒大的原核生物，广泛分布于自然界，包括一些动物与人类。到目前已从人体内分离出几种支原体，其中生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)是人类泌尿生殖道感染潜在的病原体，也是人类泌尿生殖道感染的重要病因之一。除引起尿道炎外，伴有抗体的产生，并与前列腺炎、盆腔炎性疾病有关。生殖支原体为支原体科柔膜菌纲成员，其基因组仅580kb，是最小的具有自我复制能力的生物体。生殖支原体体外培养困难，生长需要1-2个月。生殖支原体在人群中流行率平均为0.8-4.1％，性病门诊感染率更高平均为4.0-19.4％。而男性感染生殖支原体可表现为急性非淋菌性尿道炎、持续性尿道炎、附睾炎、直肠炎等；女性表现为尿道炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕、早产、异位妊娠等。在相关检测方面，主要基于MgPa粘附素基因或16SrRNA基因进行核酸扩增(PCR)，而近年，功能基因新片的成熟技术，带来非常多微生物检测应用于环境或医学临床上，而本项目乃基本独家芯片技术开发开发全国产基因芯片针对生殖支原体做高效且高精准度的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法。具体地，上述方法包括如下步骤：S1、收集样品；S2、提取基因组DNA；S3、检测生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3以及产毒特异性基因gene4；S4、读取扩增Ct值；当所述生殖支原体属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒生殖支原体的检测结果为阳性；当所述生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒生殖支原体的检测结果为阴性。作为一种优选技术方案，所述生殖支原体属特异性基因rpoB(NCBIAccessionNumber：AY191424.1)的检测引物如SEQIDNO:1～2所示：SEQIDNO:1(5'-TGATGGTAGGAGTGGAATGCC-3')；SEQIDNO:2(5'-TCCATCTCACCAAACCGCTG-3')。所述生殖支原体属特异性基因gene1(NCBIAccessionNumber：AFQ04660.1)的检测引物如SEQIDNO:3～4所示：SEQIDNO:3(5'-AAGTGATTGGTGGATTGGCAC-3')；SEQIDNO:4(5'-GGCGCAAAATCGAGGTGTTT-3')。所述生殖支原体属特异性基因gene2(NCBIAccessionNumber：AFQ04757.1)的检测引物如SEQIDNO:5～6所示：SEQIDNO:5(5'-AAGCACACATGTTAACCACCC-3')；SEQIDNO:6(5'-GCTAAGCCCATCACGCAATG-3')。所述生殖支原体属特异性基因gene3的检测引物如SEQIDNO:7～8所示：SEQIDNO:7(5'-CAAAGGATGCAAAAGCGTGGT-3')(NCBIAccessionNumber：AFQ04309.1)；SEQIDNO:8(5'-GCGTGGGTTGTTGTAAGCAT-3')(NCBIAccessionNumber：AFQ04310.1)。所述产毒特异性基因gene4(NCBIAccessionNumber：AFQ04506.1)的检测引物如SEQIDNO:9～10所示：SEQIDNO:9(5'-CAGGGGTGGCAATCTCGATT-3')；SEQIDNO:10(5'-CGTGAACCTGAATCAAGCCAC-3')。本专利技术另一目的是提供一种用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过前期对生殖支原体属和其他原体属，产毒和非产毒原体属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分生殖支原体属和其他原体属，产毒和非产毒原体属的特异性的杆基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的生殖支原体，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和原体属的特异性。(2)本专利技术中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。(3)本专利技术检测方法与市面上其他的检测方法相比，本专利技术的两部分检测策略，能够分步判断生殖支原体属和其他原体属、产毒和非产毒原体属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒生殖支原体，结果更加严谨和准确。(4)本专利技术能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。(5)本专利技术检测方法能够应用于对于临床样品、食品抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒生殖支原体，操作方便、快速、灵敏。本专利技术检测试剂盒能够应用于医疗卫生，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。附图说明图1是rpoB基因检测引物标准曲线。图2的gene1基因检测引物标准曲线。图3是gene2基因检测引物标准曲线。图4是gene3基因检测引物标准曲线。图5是gene4基因检测引物标准曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。表1在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本专利技术所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、收集样品；/nS2、提取基因组DNA；/nS3、检测生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及产毒特异性基因gene4；/nS4、读取扩增Ct值；当所述生殖支原体属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒生殖支原体的检测结果为阳性；当所述生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒生殖支原体的检测结果为阴性。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及产毒特异性基因gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述生殖支原体属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒生殖支原体的检测结果为阳性；当所述生殖支原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒生殖支原体的检测结果为阴性。


2.根据权利要求1所述的用于检测产毒生殖支原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述生殖支原体属特异性基因rpoB的检测引物如SEQIDNO:1～2所示。


3.根据权利要求1所述的用于检测产毒生殖支原体的荧光定量P...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，张智闵，连政汉，蒋华，束文圣，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44