用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明专利技术巧妙的应用了特异性的基因检测区分无乳链球菌与其它链球菌属，以及产毒和非产毒的无乳链球菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明专利技术与现有的主流检测试剂盒相比，本发明专利技术用于检测产毒无乳链球菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种通过特异性基因对产毒无乳链球菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是一种成对或成短链状排列的革兰氏阳性球菌。它是一种具有β-溶血性、过氧化氢酶阴性、VP试验阳性的兼性厌氧型细菌。无乳链球菌也称B群链球菌，根据其多糖荚膜的免疫学活性，无乳链球菌可划分为10个血清型(Ia、Ib、II–IX)。一般来说，无乳链球菌是一种无害的共生型细菌，它是人类微生物菌群的一部分，这些微生物群在30％的健康人类成年人的胃肠道和泌尿生殖道中定殖，当人体免疫功能降低时，会给无乳链球菌感染提供机会。然而，亦可引起严重的侵入性感染，是侵入性新生儿感染的重要致病菌。无乳链球菌是造成孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎的一个重要原因。它寄生在产妇生殖道，可致婴儿感染的发生。新生儿感染有两种不同的临床类别：早发型新生儿感染，其特点为出生后7日内出现脓毒症、脑膜炎与肺炎；晚发型新生儿感染，出生后7日～3月之间出现脑膜炎与脓毒症。目前，国内外对无乳链球菌及其病原学、分子流行病学进行了大量研究，建立了很多有效的分离鉴定方法，包括乳胶凝集试验、β-溶血试验、环磷酸腺苷(cAMP)ELISA检测等。这些方法不仅耗时、灵敏度低，而且出现的反应并非无乳链球菌所在B群菌株的特异性反应，C、F、G群部分链球菌亦可出现阳性结果。近年来，荧光定量PCR检测技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短等优势逐步应用于无乳链球菌的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法。具体地，上述方法包括如下步骤：S1、收集样品；S2、提取基因组DNA；S3、检测无乳链球菌属特异性基因rpoB以及产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4；S4、读取扩增Ct值；当所述无乳链球菌属特异性基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒无乳链球菌的检测结果为阳性；当所述无乳链球菌属特异性基因rpoB的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒无乳链球菌的检测结果为阴性。作为一种优选技术方案，所述无乳链球菌属特异性基因rpoB(NCBIAccessionNumber：DQ232501.1)的检测引物如SEQIDNO:1～2所示；SEQIDNO:1(5'-ACAACTTCGAGGATGCGGTT-3')；SEQIDNO:2(5'-CCCATTTCGTCCAAGTTGCG-3')。所述产毒特异性基因gene1(NCBIAccessionNumber：AYY67640.1)的检测引物如SEQIDNO:3～4所示；SEQIDNO:3(5'-ATGCAGGGCCGAGAAACTC-3')；SEQIDNO:4(5'-ACCAATCACCCCAACGTCAT-3')。所述产毒特异性基因gene2(NCBIAccessionNumber：AYZ04668.1)的检测引物如SEQIDNO:5～6所示；SEQIDNO:5(5'-TCGAAGAAGCAGGCTACAAGG-3')；SEQIDNO:6(5'-TCAACCAAACCTGCTTCAACTG-3')。所述产毒特异性基因gene3(NCBIAccessionNumber：AYZ05235.1)的检测引物如SEQIDNO:7～8所示；SEQIDNO:7(5'-CCAAACCCTCAAAGCACAGG-3')；SEQIDNO:8(5'-TGGGAGCAATGTGGGAGATG-3')。所述产毒特异性基因gene4(NCBIAccessionNumber：AYZ05496.1)的检测引物如SEQIDNO:9～10所示；SEQIDNO:9(5'-ACAAAACACATCGCCCTTGC-3')；SEQIDNO:10(5'-TCTCTGGCAACCCGTTCTTC-3')。本专利技术另一目的是提供一种用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的无乳链球菌属特异性基因rpoB的检测引物和产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的检测引物。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过前期对无乳链球菌属和其他链球菌属，产毒和非产毒链球菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分无乳链球菌属和其他链球菌属，产毒和非产毒链球菌属的特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的无乳链球菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。(2)本专利技术中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。(3)本专利技术检测方法与市面上其他的检测方法相比，本专利技术的两部分检测策略，能够分步判断无乳链球菌属和其他链球菌属、产毒和非产毒链球菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒无乳链球菌，结果更加严谨和准确。(4)本专利技术能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。(5)本专利技术检测方法能够应用于对于临床医学中的阴道分泌物、皮肤分泌物、尿液和粪便排泄物、过滤水等多方面来源临床样品筛查和检测，精准地判断出该临床样品中是否含有产毒无乳链球菌，操作方便、快速、灵敏。本专利技术检测试剂盒能够应用于多种临床样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。附图说明图1是rpoB基因检测引物标准曲线。图2的gene1基因检测引物标准曲线。图3是gene2基因检测引物标准曲线。图4是gene3基因检测引物标准曲线。图5是gene4基因检测引物标准曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。表1在一些实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、收集样品；/nS2、提取基因组DNA；/nS3、检测无乳链球菌属特异性基因rpoB，以及产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4；/nS4、读取扩增Ct值；当所述无乳链球菌属特异性基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值小于35时，产毒无乳链球菌的检测结果为阳性；当所述无乳链球菌属特异性基因rpoB的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒无乳链球菌的检测结果为阴性。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测无乳链球菌属特异性基因rpoB，以及产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述无乳链球菌属特异性基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值小于35时，产毒无乳链球菌的检测结果为阳性；当所述无乳链球菌属特异性基因rpoB的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒无乳链球菌的检测结果为阴性。


2.根据权利要求1所述的用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述无乳链球菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQIDNO:1～2所示。


3.根据权利要求1所述的用于检测产毒无乳链球菌的荧光定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，吴胜标，谢燕荣，宁大亮，石舟，蒋华，束文圣，
申请(专利权)人：广州微芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44