大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒，所述检测试剂盒包括13套LAMP检测引物，分别为aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB。通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测，采用环介导等温扩增技术，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上；无需电泳检测，直接通过观察颜色变化即可区分阴阳性；整个检测过程只需一个水浴锅即可完成检测，既提高了肉眼的识别率，又可直接用于现场疫病的诊断。

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒
本专利技术涉及大肠杆菌检测
，具体涉及大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒。
技术介绍
大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)通常被称为大肠杆菌，为人和动物肠道中的正常栖居菌。一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物具有严重致病性。根据其流行病学特征、发病机制及临床特征等，可将致泻性大肠埃希氏菌分为肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenicE.coli，EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)、肠产毒大肠埃希氏菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)、肠聚集性大肠埃希氏菌(enteroaggregativeE.coli，EAEC)。致泻大肠埃希氏菌所产生的致病物质主要包括定居因子、黏附素、外毒素以及肠毒素等，不同类型的致泻大肠埃希氏菌的侵袭部位以及产生的致病物质均有差别，可经食物和饮用水在人群中广泛传播，造成严重疫情。对致泻大肠埃希氏菌检测与甄别方法为选择性分离、生化鉴定、血清学鉴定等，实验周期较长，且一般实验室很难拥有完备的大肠杆菌诊断血清。近年已有研究采用单重PCR、多重PCR，实时荧光PCR，基因芯片等技术对致泻大肠埃希氏菌进行检测，以达到检测其毒力基因、不同致病型别区分的目的，这些方法时效性、高效性及灵敏度都较传统方法有较大改善，但是此类方法加样步骤繁琐，需要专业人员操作，需要电泳检测，荧光PCR及基因芯片用到的仪器又比较昂贵，同时检测时间虽然有缩短，但是仍然需要2-4h或更长时间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，通过设计13套LAMP检测引物，每套LAMP检测引物包括6条引物，通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测。此外，本专利技术还提供包括13套LAMP检测引物的试剂盒。本专利技术通过下述技术方案实现：大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，包括以下步骤：步骤1)、13套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、astA、bfpB、escV、ipaH、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；步骤2)、提取细菌的DNA模板；步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型。进一步的，13套LAMP检测引物，分别为aggR、astA、bfpB、escV、ipaH、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB，其中，所述aggR的外引物F31和B31的碱基序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示，所述aggR的内引物FIP1和BIP1的碱基序列分别如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示，所述aggR的成环引物LoopF1和LoopB1的碱基序列分别如SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示；所述astA的外引物F32和B32的碱基序列分别如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示，所述astA的内引物FIP2和BIP2的碱基序列分别如SEQIDNo.9、SEQIDNo.10所示，所述astA的成环引物LoopF2和LoopB2的碱基序列分别如SEQIDNo.11、SEQIDNo.12所示；所述bfpB的外引物F33和B33的碱基序列分别如SEQIDNo.13、SEQIDNo.14所示，所述bfpB的内引物FIP3和BIP3的碱基序列分别如SEQIDNo.15、SEQIDNo.16所示，所述bfpB的成环引物LoopF3和LoopB3的碱基序列分别如SEQIDNo.17、SEQIDNo.18所示；所述escV的外引物F34和B34的碱基序列分别如SEQIDNo.19、SEQIDNo.20所示，所述escV的内引物FIP4和BIP4的碱基序列分别如SEQIDNo.21、SEQIDNo.22所示，所述escV的成环引物LoopF4和LoopB4的碱基序列分别如SEQIDNo.23、SEQIDNo.24所示；所述ipaH的外引物F35和B35的碱基序列分别如SEQIDNo.25、SEQIDNo.26所示，所述ipaH的内引物FIP5和BIP5的碱基序列分别如SEQIDNo.27、SEQIDNo.28所示，所述ipaH的成环引物LoopF5和LoopB5的碱基序列分别如SEQIDNo.29、SEQIDNo.30所示；所述Ita的外引物F36和B36的碱基序列分别如SEQIDNo.31、SEQIDNo.32所示，所述Ita的内引物FIP6和BIP6的碱基序列分别如SEQIDNo.33、SEQIDNo.34所示，所述Ita的成环引物LoopF6和LoopB6的碱基序列分别如SEQIDNo.35、SEQIDNo.36所示；所述Itb的外引物F37和B37的碱基序列分别如SEQIDNo.37、SEQIDNo.38所示，所述Itb的内引物FIP7和BIP7的碱基序列分别如SEQIDNo.39、SEQIDNo.40所示，所述Itb的成环引物LoopF7和LoopB7的碱基序列分别如SEQIDNo.41、SEQIDNo.42所示；所述pic的外引物F38和B38的碱基序列分别如SEQIDNo.43、SEQIDNo.44所示，所述pic的内引物FIP8和BIP8的碱基序列分别如SEQIDNo.45、SEQIDNo.46所示，所述pic的成环引物Loop8和LoopB8的碱基序列分别如SEQIDNo.47、SEQIDNo.48所示；所述stp的外引物F39和B39的碱基序列分别如SEQIDNo.49、SEQIDNo.50所示，所述stp的内引物FIP9和BIP9的碱基序列分别如SEQIDNo.51、SEQIDNo.52所示，所述stp的成环引物LoopF9和LoopB9的碱基序列分别如SEQIDNo.53、SEQIDNo.54所示；所述sth的外引物F310和B310的碱基序列分别如SEQIDNo.55、SEQIDNo.56所示，所述sth的内引物FIP10和BIP10的碱基序列分别如SEQIDNo.57、SEQIDNo.58所示，所述sth的成环引物LoopF10和LoopB10的碱基序列分别如SEQIDNo.59、SEQIDNo.60所示；所述stx1A的外引物F311和B311的碱基序列分别如SEQIDNo.61、SEQIDNo.62所示，所述stx1A的内引物FIP11和BIP11的碱基序列分别如SEQIDNo.63、SEQIDNo.64所示，所述stx1A的成环引物Lo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1)、13套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；/n步骤2)、提取细菌的DNA模板；/n步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型。/n

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)、13套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、astA、bfpB、escV、ipaH、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；
步骤2)、提取细菌的DNA模板；
步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型。


2.根据权利要求1所述的大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，所述13套LAMP检测引物，分别为aggR、astA、bfpB、escV、ipaH、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB，其中，所述aggR的外引物F31和B31的碱基序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示，所述aggR的内引物FIP1和BIP1的碱基序列分别如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示，所述aggR的成环引物LoopF1和LoopB1的碱基序列分别如SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示；所述astA的外引物F32和B32的碱基序列分别如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示，所述astA的内引物FIP2和BIP2的碱基序列分别如SEQIDNo.9、SEQIDNo.10所示，所述astA的成环引物LoopF2和LoopB2的碱基序列分别如SEQIDNo.11、SEQIDNo.12所示；所述bfpB的外引物F33和B33的碱基序列分别如SEQIDNo.13、SEQIDNo.14所示，所述bfpB的内引物FIP3和BIP3的碱基序列分别如SEQIDNo.15、SEQIDNo.16所示，所述bfpB的成环引物LoopF3和LoopB3的碱基序列分别如SEQIDNo.17、SEQIDNo.18所示；所述escV的外引物F34和B34的碱基序列分别如SEQIDNo.19、SEQIDNo.20所示，所述escV的内引物FIP4和BIP4的碱基序列分别如SEQIDNo.21、SEQIDNo.22所示，所述escV的成环引物LoopF4和LoopB4的碱基序列分别如SEQIDNo.23、SEQIDNo.24所示；所述ipaH的外引物F35和B35的碱基序列分别如SEQIDNo.25、SEQIDNo.26所示，所述ipaH的内引物FIP5和BIP5的碱基序列分别如SEQIDNo.27、SEQIDNo.28所示，所述ipaH的成环引物LoopF5和LoopB5的碱基序列分别如SEQIDNo.29、SEQIDNo.30所示；所述Ita的外引物F36和B36的碱基序列分别如SEQIDNo.31、SEQIDNo.32所示，所述Ita的内引物FIP6和BIP6的碱基序列分别如SEQIDNo.33、SEQIDNo.34所示，所述Ita的成环引物LoopF6和LoopB6的碱基序列分别如SEQIDNo.35、SEQIDNo.36所示；所述Itb的外引物F37和B37的碱基序列分别如SEQIDNo.37、SEQIDNo.38所示，所述Itb的内引物FIP7和BIP7的碱基序列分别如SEQIDNo.39、SEQIDNo.40所示，所述Itb的成环引物LoopF7和LoopB7的碱基序列分别如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保宁，索朗斯珠，贡嘎，罗润波，周永君，
申请(专利权)人：四川大学，西藏农牧学院，成都乐助生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51