牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。所述试剂盒的引物是金黄色葡萄球菌femB基因序列、大肠杆菌phoA基因序列和沙门氏菌invA基因序列的特异性引物。本发明专利技术通过对多重PCR反应进行优化，通过优化试验，确定该试剂盒的多重PCR的最佳扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。本发明专利技术提供的多试剂盒可以对临床牛奶样本中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定。试验结果证实，该试剂盒检测时间短、敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒
本专利技术属于食源性致病菌检测
，尤其是牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。
技术介绍
食源性致病菌是引起人类健康和食品安全的主要因素之一，而微生物污染是导致牛奶质量问题的重要因素，因此牛奶中的致病菌成为消费者关注的焦点。而我国对原料奶的质量要求远低于乳业发达国家。我国乳品新国标中仅规定了生奶中细菌的最低检出总数(少于2×106个/mL)，未对牛奶中具体的细菌种类进行规定，这忽视病原菌的检测。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌则是牛奶源主要的致病菌，这些食源性致病菌严重影响着人和动物的健康。因此，需要快捷、灵敏地方法对牛奶中食源性致病菌进行检测。目前也有不少关于牛奶食源性致病菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测研究，但没有关于牛奶中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌这3种致病菌的同时检测研究。如公开号为CN104911249A的专利公开了一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒；所述试剂盒包括(1)牛奶中微生物的提取试剂，(2)PCR检测试剂，其中包括3对特异性的mntc基因的引物，(3)阳性对照，(4)阴性对照和(5)空白质控标准品。又如公开号为CN108570512A的专利公开金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法。本专利技术的PCR检测方法灵敏度高：金黄色葡萄球菌和沙门氏菌灵敏度为105copies/μL，而大肠杆菌灵敏度104copies/μL。该专利技术虽然实现了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的同时检测，但是荧光定量PCR耗材昂贵，目前在县级基层以及养殖场还没有普及，且操作技术要求高，对操作环境洁净度要求高，由于环境污染易产生假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。多重PCR(multiplexPCR，mPCR)方法可同时检测多种病原体，且具有特异性强、灵敏度高、检测时间短和检测成本低等特点，适合大量临床样本(特别是混合感染样本)中病原体的快速检测。本专利技术研究者以金黄色葡萄球菌femB基因序列、大肠杆菌phoA基因序列和沙门氏菌invA基因序列，分别设计3对特异性引物，建立一种能够同时快速检测牛奶中三种食源性致病菌的多重PCR方法。具体是通过以下技术方案实现的：牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。优选地，所述试剂盒还包括Ⅱ液，Ⅱ液为2U/μLDNA聚合酶。优选地，所述试剂盒还包括PCR反应混合溶液(PremixExTaq)，其组成为：5mmol/μL氯化镁、1000pmol/μLdNTP4.0μL、25mmol/μLTris-HCl、0.2μLTaq。优选地，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照。优选地，所述阴性对照为超纯水，阳性对照为金黄色葡萄球菌femB基因、大肠杆菌phoA基因、沙门氏菌invA基因三基因的克隆质粒。优选地，所述试剂盒包括：40μLⅠ液、250μLⅡ液、250μLPCR反应混合溶液(PremixExTaq)、20μL阴性对照、20μL阳性对照；Ⅰ液由10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物等体积组成。优选地，所述试剂盒的PCR扩增体系为：PremixTaq25μL，DNA混合模板2μL，10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物各1μL，ddH2O加至50μL。优选地，所述试剂盒的扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。优选地，所述试剂盒的扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。优选地，所述电泳检测：在233bp、444bp和724bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的试剂盒，能从金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的混合模板中同时扩增出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌特异性目的条带；且各引物与模板之间没有明显的互相干扰，能同时实现牛奶中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的检测。而且，其它的病原菌牛结核杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体为模板，进行PCR扩增试验时，均未出现目的条带，特异性高。本专利技术提供的试剂盒，敏感性好，对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌同时检测时，最低检测量分别为：133.3pg/mL,13.3pg/mL,13.3pg/mL。本专利技术提供的多试剂盒可以对临床牛奶样本中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定。试验结果证实，该试剂盒检测时间短、敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。附图说明图1为沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测结果，M：DL2000；1：沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌多重PCR产物；2：沙门氏菌单一PCR产物；3：大肠杆菌单一PCR产物；4：金黄色葡萄球菌单一PCR产物；5、6：多重PCR阴性对照。图2为多重PCR敏感性与特异性试验结果，M：D2000；1～10：10－1～10－10稀释的细菌DNA的PCR结果；11：牛结核杆菌；12：多杀性巴氏杆菌；13：牛支原体；14：牛结核杆菌+多杀性巴氏杆菌+牛支原体；15：阴性对照。图3为沙门氏菌单一PCR敏感性试验结果，M：D2000；1～11：10-1～10-11稀释的沙门氏菌DNA的PCR结果；12、13：阴性对照。图4为大肠杆菌单一PCR敏感性试验结果，M：MarkerDL2000；M：D2000；1～11：10-1～10-11稀释的大肠杆菌DNAPCR结果；12、13：阴性对照。图5为金黄色葡萄球菌单一PCR敏感性试验结果，M：D2000；1～11：10-1～10-11稀释的大肠杆菌DNAPCR结果；12～15：阴性对照。具体实施方式下面结合具体的实施方式来对本专利技术的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：/n金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′/n金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′/n大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′/n大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′/n沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′/n沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。/n

【技术特征摘要】
1.牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：
金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′
金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′
大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′
大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′
沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′
沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。


2.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Ⅱ液，Ⅱ液为2U/μLDNA聚合酶。


3.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应混合溶液(PremixExTaq)，其组成为：5mmol/μL氯化镁、1000pmol/μLdNTP4.0μL、25mmol/μLTris-HCl、0.2μLTaq。


4.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照。


5.如权利要求4所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为超纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚楠，赵贵，陈锡龙，焦仁刚，姜玲玲，余波，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52