一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法。本发明专利技术提供了一种构建用于检测ctDNA低频突变的文库的方法，依次包括如下步骤：(1)将ctDNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；(2)将步骤(1)处理后的ctDNA与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库。本发明专利技术具有以下优点：1、使用了barcode标签，并将其简化为4bp长的序列组合，提高利用率，提高检测灵敏度，合成简单，成本低，使用方便，极大的提高了adapter的连接效率和测序数据中duplex标记分子的比例。2、使用的识别duplex的生物信息分析方法，可以快速有效去除测序、捕获和PCR过程中引入的错误，降低检测的假阳性。

【技术实现步骤摘要】
一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法
本专利技术涉及一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法。
技术介绍
ctDNA(circulatingtumorDNA)，即循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞释放的存在于血液、脑脊液等体液中DNA片段，是一种特征性的肿瘤生物标记物。ctDNA的变异检测，可用于肿瘤的早期诊断、肿瘤发生发展及疗效的动态监测、耐药检测、复发风险评估等。ctDNA在血浆等体液中的含量很低，通常小于总cfDNA的1％，变异检测难度极大。目前用于ctDNA突变检测的技术主要有ARMS法(主要是Super-ARMS)、第二代测序(NGS)和数字PCR(dPCR，包括BEAMing技术)。Super-ARMS及数字PCR技术简便快速，特异性及灵敏度均较高，缺点是只能检测有限个数的已知突变，通量低。NGS通量高，检测基因数量不受限，可检测已知或未知突变。但是NGS技术复杂、耗时长且不易标准化，文库制备及测序的过程中都可能引入假阳性，影响结果判读。NGS检测结果的假阳性主要有三个来源：1.文库制备过程中积累的PCR错误；2.测序过程中产生的测序错误；3.样品间污染，主要是HiseqX、Novaseq等测序平台固有技术缺陷造成的index标定到错误样品上的问题，又称作“标签跳跃”(indexhopping)。Duplex技术在文库构建时利用特殊的接头序列，能够在目的片段的两侧引入随机的标签序列，从而标记来源于同一分子的正负链。通过正负链双重矫正，可以极大的减少PCR错误和测序错误带来的假阳性。该技术在ctDNA变异检测的应用中，存在两个主要的问题：1.接头序列纯度较低，连接过程中造成原始分子损失；2.测序结果中检测到的duplex比例很低(10％-15％左右)，大部分分子无法进行正负链矫正。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法。本专利技术提供了一种构建用于检测ctDNA低频突变的文库的方法，依次包括如下步骤：(1)将ctDNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；(2)将步骤(1)处理后的ctDNA与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库；所述接头混合物由n个接头组成；每个接头均由一条上游引物甲和一条下游引物甲形成部分双链结构得到；上游引物甲中具有barcode标签甲；下游引物甲中具有barcode标签乙；barcode标签甲和barcode标签乙反向互补；barcode标签甲由A、T、C和G组成，排列顺序任意；n个接头采用n个不同的barcode标签甲；n为≥8的任意自然数。所述上游引物甲的3’末端的第一个核苷酸为具有修饰的T；所述修饰的目的为防止核酸外切酶降解；下游引物甲的5’末端进行磷酸化修饰。所述上游引物甲中还具有adapter序列1；所述下游引物甲中还具有adapter序列2；adapter序列1和adapter序列2根据测序平台选择，二者中部分区段反向互补；n个接头采用相同的adapter序列1和adapter序列2。所述部分双链结构由标签甲和adapter序列1中的部分序列与barcode标签乙和adapter序列2中的部分序列反向互补得到。所述上游引物甲自5’端依次为adapter序列1、barcode标签甲和碱基T。所述下游引物甲自5’端依次为barcode标签乙和adapter序列2。所述接头可以通过将上游引物甲和下游引物甲进行退火得到。所述接头混合物中，每个接头等摩尔混合。当测序平台为illumina测序平台时，adapter序列1具体可如序列表的序列1自5’端第1至21位所示，所述adapter序列2具体可如序列表的序列2自5’端第5至26位所示。所述n具体可为12。当n为12时，12个接头的barcode标签甲分别如序列表的序列1自5’端第22至25位、序列3自5’端第22至25位、序列5自5’端第22至25位、序列7自5’端第22至25位、序列9自5’端第22至25位、序列11自5’端第22至25位、序列13自5’端第22至25位、序列15自5’端第22至25位、序列17自5’端第22至25位、序列19自5’端第22至25位、序列21自5’端第22至25位和序列23自5’端第22至25位所示。当n为12时，所述12个接头如下：接头1由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头2由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头3由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头4由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头5由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头6由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头7由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头8由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头9由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头10由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头11由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头12由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到。所述方法中，所述PCR扩增采用的引物对由上游引物乙和下游引物乙组成；所述下游引物乙中包括index标签序列。所述上游引物乙具体可如序列表的序列25所示。所述下游引物乙自5’端依次为区段甲、index标签序列和区段乙。所述区段甲如序列表的序列26所示，所述区段乙如序列表的序列27所示。所述方法还包括将PCR扩增后的文库进行目标区域捕获的步骤。所述目标区域捕获可采用现有的文库捕获商用试剂盒，其中的panel可替换为任意含有目标突变的panel。本专利技术还保护以上任一所述的方法制备得到的文库。本专利技术还保护以上任一所述的方法或文库在检测ctDNA样本中目标突变及其突变频率中的应用。本专利技术还保护一种用于构建ctDNA低频突变检测文库的试剂盒，包括以上任一所述接头混合物。所述试剂盒还包括用于ctDNA提取的试剂、用于DNA建库的试剂、用于文库纯化的试剂、用于文库捕获的试剂等用于文库构建的材料。本专利技术还保护一种检测ctDNA样本中目标突变及其突变频率的方法，包括如下步骤：(1)按照以上任一所述的方法制备文库；(2)测序所述文库，得到测序结果，根据测序结果分析ctDNA样本中目标突变及其突变频率。所述测序结果的分析方法如下：(a)将测序结果比对到人参考基因组hg19上；(b)在基因组上具有相同起始和终止位置，以及具有相同barcode标签的一簇reads，来自于同一分子的同一条链。对同一簇的reads进行比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建用于检测ctDNA低频突变的文库的方法，依次包括如下步骤：(1)将ctDNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；(2)将步骤(1)处理后的ctDNA与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库；所述接头混合物由n个接头组成；每个接头均由一条上游引物甲和一条下游引物甲形成部分双链结构得到；上游引物甲中具有barcode标签甲；下游引物甲中具有barcode标签乙；barcode标签甲和barcode标签乙反向互补；barcode标签甲由A、T、C和G组成，排列顺序任意；n个接头采用n个不同的barcode标签甲；n为≥8的任意自然数。

【技术特征摘要】
1.一种构建用于检测ctDNA低频突变的文库的方法，依次包括如下步骤：(1)将ctDNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；(2)将步骤(1)处理后的ctDNA与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库；所述接头混合物由n个接头组成；每个接头均由一条上游引物甲和一条下游引物甲形成部分双链结构得到；上游引物甲中具有barcode标签甲；下游引物甲中具有barcode标签乙；barcode标签甲和barcode标签乙反向互补；barcode标签甲由A、T、C和G组成，排列顺序任意；n个接头采用n个不同的barcode标签甲；n为≥8的任意自然数。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：上游引物甲的3’末端的第一个核苷酸为具有修饰的T；所述修饰的目的为防止核酸外切酶降解；下游引物甲的5’末端进行磷酸化修饰。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：n＝12。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：12个接头的barcode标签甲分别如序列表的序列1自5’端第22至25位、序列3自5’端第22至25位、序列5自5’端第22至25位、序列7自5’端第22至25位、序列9自5’端第22至25位、序列11自5’端第22至25位、序列13自5’端第22至25位、序列15自5’端第22至25位、序列17自5’端第22至25位、序列19自5’端第22至25位、序列21自5’端第22至25位和序列23自5’端第22至25位所示。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述12个接头如下：接头1由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头2由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头3由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头4由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头5由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头6由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头7由序列表的序列13所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王沛，马兴勇，谭达，杨洁，李光宇，阎海，王思振，王晓月，焦宇辰，
申请(专利权)人：北京泛生子基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11