一种肿瘤样品测序参考品的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，属于高通量测序技术领域，所述方法包括以下步骤：对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系并提取全基因组；测定等位基因频率测定；根据等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数；用阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；提取混合细胞的全基因组，测定等位基因突变频率；根据混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，细化倍比稀释的倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。本发明专利技术所述方法采用对细胞株单克隆结合高通量测序确定细胞系的基因背景；使用多步骤逐步细化的倍比稀释法结合流式细胞仪对细胞精确计数，保证参考品制备的高度可重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤样品测序参考品的制备方法
本专利技术属于高通量测序
，尤其涉及一种肿瘤样品测序参考品的制备方法。
技术介绍
高通量测序不仅能够明确判断与疾病相关的基因是否发生变异而且能够提供更多量化的信息，在临床诊断应用上日益被人们所接受。但高通量测序技术的临床应用仍然具有一定的挑战性，其中诊断错误率高就是一个主要的问题，为了降低诊断错误率，人们在测序机器性能的升级、实验方案的设计和生信分析流程等几方面进行了不断的努力，但是目前高通量测序的诊断错误率仍然较高。造成这个现象的重要原因之一：测序过程中所用参考品的质量不足以满足临床检测的要求，这一原因往往被忽视，由于缺乏高质量的参考品从而导致不同检测实验室、不同操作人员、不同测序平台之间的结果无法进行科学系统的比较。高质量的参考品可以更好的解决这些问题，它可以标准化基因组的定性和定量参数，提高临床诊断的准确性、可靠性和标准化，降低诊断错误率，使测序数据能够提供准确且有诊断价值的结果。一个合格的参考品需要对参考品量化、参考品的等位基因频率和肿瘤相关突变情况有明确的数据；另外对于特定测序项目还需要做到能涵括所要检测的变异类型，突变位点的具体频率等信息。只有做到以上这些要求，才能做到对每次测序检测的准确性和稳定性进行评估。简而言之，测序参考品需要突变信息精确定义、精准量化，并且保证高度稳定。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种操作简便且准确的肿瘤样品高通量测序参考品的制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定对单克隆细胞系的稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞按照步骤4)中确定的稀释倍数稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化倍比稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。优选的，所述肿瘤细胞系包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS174T，SW1417或SW48。优选的，步骤1)获得单克隆细胞系后还包括筛选步骤；所述筛选为提取单克隆细胞系的全基因组，进行3～5次高通量测序获得3～5个等位基因突变频率，筛选等位基因突变频率稳定的单克隆细胞系。优选的，步骤4)中所述稀释倍数为1.5～2.5倍。优选的，步骤5)中所述阴性细胞为Hela细胞。优选的，所述高通量测序采用达安基因的个人化操作基因组测序仪PGMTM。优选的，所述目标等位基因突变频率为确定肿瘤样品测序检测限所需等位基因突变频率或肿瘤样品测序的阳性质控品所需等位基因突变频率。优选的，所述目标等位基因突变频率为1％、2％、5％或15％。优选的，步骤7)获得参考品后还包括提取所述参考品的全基因组，将所述参考品的全基因组在2～4种不同测序平台进行高通量测序测定等位基因突变频率，筛选在不同测序平台测定的等位基因突变频率一致且稳定的参考品。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的肿瘤样品测序参考品的制备方法，对肿瘤细胞系进行单克隆培养，最大程度确保细胞系的基因背景清晰；使用高通量测序来对等位基因频率进行测定，在保证了基因背景的清晰的前提下，还能确保本参考品可以应用高通量测序平台上。本专利技术采用细胞流式仪计数是保证计数精准、确保后续倍比稀释稳定性和放大大规模生产时的规范性。进一步的，本专利技术首次倍比梯度稀释初始采用1.5～2.5倍的倍比稀释系数对于初步确定等位基因频率为1％，2％，5％和15％的稀释范围较为理想，并且为后续的进一步细化倍比稀释提供参考；本专利技术中，以细胞数计，先混合细胞进行倍比稀释后，再提取基因组，而不采用先分别提取基因组后混合，重复型好，能够最大程度减少量化的客观性，减少人为引入影响因素。本专利技术中细化倍比稀释参数可根据不同情况进行调整，一般考虑接近1％，2％，5％和15％的一侧进行调整；进一步的，本专利技术采用不同高通量测序平台检测，考虑目前市面的高通量测序平台较多，故而需在不同测序平台上对参考品的重要参数加以确认。具体实施方式本专利技术提供一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化倍比稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。在本专利技术中，所述所述肿瘤细胞系优选为对临床检测具有明确的参考意义的具有肿瘤热点突变的细胞系；在本专利技术中，所述肿瘤细胞系优选的包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS174T，SW1417或SW48；本专利技术中上述肿瘤细胞系优选的来源于美国模式菌种收集中心ATCC；本专利技术上述8个肿瘤细胞系涵括了肺癌热点突变的5个基因，9个外显子，并且包含了肺癌常见热点突变类型。本专利技术对所述对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系。在本专利技术中，所述单克隆培养的方法优选的包括以下步骤：将所述肿瘤细胞计数后，分到96孔板里，确保每个孔道中细胞个数为0.5，从而使得一部分孔道中出现单个细胞，部分孔道中无细胞；培养上述细胞，获得单克隆细胞培养系。本专利技术在获得所述单克隆细胞培养系后，还包括筛选步骤；所述筛选为提取单克隆细胞系的全基因组，进行3～5次高通量测序获得3～5个等位基因突变频率，筛选等位基因突变频率稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养，获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定，获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率，确定对单克隆细胞系的稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞按照步骤4)中确定的倍数稀释所述单克隆细胞系，获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定，获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。...

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养，获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定，获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率，确定对单克隆细胞系的稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞按照步骤4)中确定的倍数稀释所述单克隆细胞系，获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定，获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。2.根据权利要求1所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞系包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈伟强，胡文玮，孙春丽，田慧，焦海涛，史善甫，刘璐，叶佳慧，奚云，葛海鹏，陈悦科，
申请(专利权)人：安徽鼎晶生物科技有限公司，上海鼎晶生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34