一种BRCA高通量测序文库及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种BRCA高通量测序文库的构建方法，属于高通量测序领域。本发明专利技术提供的BRCA高通量测序文库的构建方法包括初始文库的生成，初始文库的纯化，测序文库的生成和测序文库的纯化。本发明专利技术提供的BRCA高通量测序文库构建方法全程在一个容器中进行，避免了交叉污染的可能性。本发明专利技术提供的方法利用磁珠反应结合洗涤操作，最大程度保证了纯化的高效和便捷。利用本发明专利技术提供的方法，能使模板的利用率大大提高。

A BRCA High Throughput Sequencing Library and Its Construction Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种BRCA高通量测序文库及其构建方法和应用
本专利技术属于高通量测序
，具体涉及一种BRCA高通量测序文库及其构建方法和应用。
技术介绍
类乳腺癌易感基因(BRCA1/2)首先在乳腺癌家族中被发现，为具有遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因。BRCA1定位于人类17号染色体q21，以常染色体显性遗传方式遗传，有很高的外显率。BRCA1长约100kb，含24个外显子，其基因产物是1863个氨基酸所构成的磷酸化蛋白质。BRCA2定位于人类13号染色体q12，全基因组DNA长约70kb，其中编码区长约10kp。BRCA2的基因序列与BRCA1无明显关系，其由27个外显子组成，其中第11个外显子长约4932bp，mRNA长约10.2kb，编码的BRCA2蛋白含3418个氨基酸。BRCA1/2基因结构与功能的异常与乳腺癌及卵巢癌的发生密切相关，其作为一种抑癌基因，不仅能抑制细胞生长，还参与细胞周期调控，基因转录调节，DNA损伤修复以及凋亡等多种重要细胞活动，在维持基因组稳定性中起重要作用。目前，高通量测序技术已广泛应用到医学研究和临床诊断领域，为致癌位点的检测提供了新的检测手段。高通量测序技术因其结果覆盖范围的全面性，以及不断下降的测序成本，在医学研究和临床应用中表现出越来越高的性价比。有限的样本量和检测报告输出的时效性对该技术提出了更高的要求。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法，缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率成为高通量测序技术拓展应用领域的一大关键点。经典的高通量文库构建步骤包括：1.基因组打断(包括物理打断法和化学打断法，如covaris超声打断、fragmentase酶切打断)；2.双链DNA(Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)末端修复；3.3’末端加dATP(deoxyadenosinetriphosphate，三磷酸脱氧腺苷)；4.加与测序平台匹配的接头；5.PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)扩增。每个步骤间都需要进行纯化反应，有时还需要在酶反应之后进行一次片段选择(步骤1、4、5其中之一)，整个流程需要大概8～9个小时才能完成。经典的高通量文库构建方法是目前接受度最广、数据表现最稳定、数据偏向性最少的建库方法，但其建库过程耗时较长，步骤过多且纯化过程中目的片段的损失，使得文库的模板的利用率不高，且可能造成交叉污染。经典的高通量文库构建方法日益无法满足快速发展的市场对低起始量微量建库和快速报告周期的需求。
技术实现思路
鉴于上述技术问题，本专利技术提供了一种BRCA高通量测序文库及其构建方法和应用。利用本专利技术提供的方法构建BRCA高通量测序文库，用时短，全部操作在一个管内进行，不会引发交叉污染。本专利技术提供了一种BRCA高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：(1)以包括类乳腺易感基因的DNA片段为模板，在容器中进行多重PCR扩增，得到BRCA初始文库；(2)向所述容器中加入0.8～1.2倍PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第一磁珠；(3)对步骤(2)所述第一磁珠上吸附的BRCA初始文库进行清洗纯化；(4)对所述清洗纯化后的BRCA初始文库依次进行加A反应和连接反应，得到BRCA测序文库；(5)向装有所述BRCA测序文库的原容器中加入0.8～1.2倍加A反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第二磁珠；(6)对步骤(5)所述第二磁珠进行清洗纯化，得到纯化磁球；(7)洗脱所述纯化磁珠表面的DNA，连接后得到的洗脱液即为纯化的BRCA测序文库；所述步骤(1)～(7)在同一个容器中操作。优选的，所述模板为B150A_1～60或B150B_1～60；当所述模板为B150A_1～60时，扩增B150A_1～60用引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1～120所示。优选的，所述步骤(1)中多重PCR扩增采用25μl的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括以下含量的组分：组分体积聚合酶Mix12.5μl引物库7μlDNA模板0.5μl水5μl其中，所述聚合酶Mix中含有聚合酶、dNTP和反应所需的缓冲体系，优选购自苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9333。优选的，所述步骤(1)中多重PCR扩增程序为：98℃，3min；98℃，30s，58℃，15s，22个循环；72℃，15s，72℃，4min。优选的，所述步骤(3)中的清洗用溶剂包括磁珠洗液和体积比68～72％的乙醇水溶液。优选的，所述步骤(4)加A反应用20μl的加A体系进行，所述加A体系包括1μL5U/μL的KlenowFragment，0.5μL10U/μL的T4PNK，2μL10×CustsmartBuffer，0.25μL10mMdATP，0.25μL100mM乙酸镁，8μL水和8μL的经纯化的PCR产物，所述PCR产物的总量为100ng。优选的，所述加A反应程序为：37℃，30min，75℃，20min。其中37℃为加A反应，75℃是对25μl体系内的生物活性物质进行灭活。优选的，所述步骤(4)连接反应用25μL的连接体系进行，所述连接体系为完成加A反应的20μL体系中添加0.5μL10×CustsmartBuffer，2μL600U/μL的连接酶，2.5μL10uM测序接头。优选的，所述连接反应程序为：25℃，2h，65℃，10min。本专利技术还提供了上述构建方法得到的BRCA高通量测序文库。有益效果：本专利技术提供了一种BRCA高通量测序文库的构建方法，该方法的全部操作在一个容器中进行，不仅减少了目的片段的损失，还避免了交叉污染的可能性。本专利技术提供的方法利用磁珠反应结合洗涤操作，最大程度保证了纯化的高效和便捷。利用本专利技术提供的方法，能使模板的利用率大大提高。由于本专利技术提供的BRCA高通量文库构建方法操作简单，不用更换容器，结合磁珠纯化的方法，可实现BRCA高通量文库的自动化构建。附图说明图1-A为本专利技术实施例1所述文库质控中转化前的检测结果；图1-B为本专利技术实施例1所述文库质控中转化后的检测结果；图1-C为本专利技术实施例1所述文库质控中纯化前的检测结果；图1-D为本专利技术实施例1所述文库质控中纯化后的检测结果；图2为本专利技术实施例2所述自动化建库设备设计方案图。具体实施方式本专利技术提供了一种BRCA高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：(1)以包括类乳腺易感基因的DNA片段为模板，在容器中进行多重PCR扩增，得到BRCA初始文库；(2)向所述容器中加入0.8～1.2倍PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第一磁珠；(3)对步骤(2)所述第一磁珠上吸附的BRCA初始文库进行清洗纯化；(4)对所述清洗纯化后的BRCA初始文库依次进行加A反应和连接反应，得到BRCA测序文库；(5)向装有所述BRCA测序文库的原容器中加入0.8～1.2倍加A反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第二磁珠；(6)对步骤(5)所述第二磁珠进行清洗纯化，得到纯化磁球；(7)洗脱所述纯化磁珠表面的DNA，连接后得到的洗脱液即为纯化的BRCA测序文库；所述步骤(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BRCA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以包括类乳腺易感基因的DNA片段为模板，在容器中进行多重PCR扩增，得到BRCA初始文库；(2)向所述容器中加入0.8～1.2倍PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第一磁珠；(3)对步骤(2)所述第一磁珠上吸附的BRCA初始文库进行清洗纯化；(4)对所述清洗纯化后的BRCA初始文库依次进行加A反应和连接反应，得到BRCA测序文库；(5)向装有所述BRCA测序文库的原容器中加入0.8～1.2倍加A反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第二磁珠；(6)对步骤(5)所述第二磁珠进行清洗纯化，得到纯化磁球；(7)洗脱所述纯化磁珠表面的DNA，连接后得到的洗脱液即为纯化的BRCA测序文库；所述步骤(1)～(7)在同一个容器中操作。

【技术特征摘要】
1.一种BRCA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以包括类乳腺易感基因的DNA片段为模板，在容器中进行多重PCR扩增，得到BRCA初始文库；(2)向所述容器中加入0.8～1.2倍PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第一磁珠；(3)对步骤(2)所述第一磁珠上吸附的BRCA初始文库进行清洗纯化；(4)对所述清洗纯化后的BRCA初始文库依次进行加A反应和连接反应，得到BRCA测序文库；(5)向装有所述BRCA测序文库的原容器中加入0.8～1.2倍加A反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到第二磁珠；(6)对步骤(5)所述第二磁珠进行清洗纯化，得到纯化磁球；(7)洗脱所述纯化磁珠表面的DNA，连接后得到的洗脱液即为纯化的BRCA测序文库；所述步骤(1)～(7)在同一个容器中操作。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述模板为B150A_1～60或B150B_1～60；当所述模板为B150A_1～60时，扩增B150A_1～60用引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1～120所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中多重PCR扩增采用25μl的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括以下含量的组分：12.5μL聚合酶Mix，5μL水，7μL引物库，0.5μL核酸模板。...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈伟强，胡文玮，焦海涛，何志辉，熊江红，谢秒秒，张瑞华，叶嘉惠，李飞燕，朱建华，廖敔，方姝，葛海鹏，
申请(专利权)人：安徽鼎晶生物科技有限公司，上海鼎晶生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34