一种极速核酸扩增的方法及其设备和应用技术

本发明专利技术公开了一种极速核酸扩增检测的方法，将核酸扩增反应管在超高温区和超低温区重复短时放置，超高温区为100℃‑150℃中的一个温度点；超低温区为10℃‑40℃中的一个温度点；如此30‑45个循环、在8‑15分钟内完成核酸扩增检测过程。本发明专利技术还公开了一种用于极速核酸扩增的反应器，包括调节范围为100℃‑150℃中的一个固定温度的超高温反应区和调节范围为10℃‑40℃中的一个固定温度超低温反应区。本发明专利技术还公开了一种用于上述极速核酸扩增的操作软件系统和设备。

A Method of Extreme Speed Nucleic Acid Amplification and Its Equipment and Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种极速核酸扩增的方法及其设备和应用
本专利技术涉及用于生物学、医学等领域的基因检测方法及其设备和应用，具体涉及一种极速核酸扩增的方法及其设备和应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)简称PCR，已经成为核酸检测的常规技术。一个典型的PCR程序通常是将反应样品经过反复的高温变性—低温复性—适温延伸三个基本反应步骤构成，即在90-95℃高温处理10-30秒左右，然后以不同方式降温至50-65℃、维持约10-30秒后升温到72℃左右维持30-60秒，如此往复30-40个周期。按照《分子克隆实验指南》一书中记载的典型的PCR三步循环扩增过程程序通常为：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，循环30次。针对短片段也可以进行两步循环的扩增方法，如94℃30秒，60℃30秒。整个反应过程中，实际实验时间还包括反应块升降温过程所需的时间、目前扩增仪的变温速率多在3℃/秒之内，一个升降温循环共需时间共约30秒之上，通常一个完整的PCR过程一般需要一个小时以上。而实际上，其中对PCR反应本身最重要的是PCR管内反应液温度，只要达到要求的PCR管内温度即可进行正常反应。现在升降温方式有多种，比如气体加温、水加温及电热块、半导体块升降温等，而且主流PCR仪通过半导体反复升降温实现自动扩增和检测，但是最快的升降温速率也不超过3℃/秒，而管内反应液的温度变化速率则更低，故在PCR全程时间上受到限制。随着PCR技术不断得到广泛的应用，利用PCR技术对不同类型的样本检测及样本检测量的增多，使得对分析效率和成本提出了更高的要求。因此，进一步缩短PCR扩增时间，发展快速PCR技术，对于大样本量的快速检测及特殊样品如临床样品的时效性具有十分重要的意义。在医院或实验室，PCR检测法是经常需要用到的非常有效的手段。在特殊情况下，特别是医院中，由于对诊断的时效性要求越来越高，就越要求PCR的高效及时。但是由于目前PCR过程仍存在反应时间较长，并需要批次反应即周期较长的问题，要等待上一个批次反应完成才能开始下一个批次的反应，这样造成PCR仪器使用效率不高，而且也很影响工作效率。因此，为适应快速扩增的方法的实现，也需要配备合适的设备。
技术实现思路
为克服上述技术缺陷，本专利技术的目的是提供一种极速核酸扩增的方法及其设备和应用。通过设置PCR管外反应块温度与PCR管内目标反应温度的较大温差，并直接通过机械运动将PCR管转移到相应反应块上，如此，通过大温差促使反应管内温度传导加速，大大缩短PCR管内温度升降温速率，使PCR过程所需的时间大大缩短，提高PCR仪器的使用率；而且通过温度模块反应管孔的链式排列及递进方式的设计，避免只能一批一批进行PCR，从而实现直接可随时添加样本及反应。为实现上述目的，采用如下的技术方案：本专利技术的极速核酸扩增的方法为将装有反应混合液的反应管置于超高温反应区和超低温反应区，进行30-45个循环，所述超高温反应区的温度为：100℃-150℃中的一个固定温度或温度区间，温度点选择根据管材的不同、以确保管内反应管内液体实际温度在88℃-95℃区间能维持1-3秒使得DNA片段双链完成变性；所述超低温反应区的温度为10℃-40℃中的一个固定温度或温度区间，温度点选择根据管材的不同、以确保反应管内液体实际温度在55℃-65℃区间能维持2-4秒完成模板与引物的复性，同时在快速升降温过程中完成DNA链延伸及荧光检测等步骤；所述循环的程序为：在所述超高温区反应4-10秒，再在所述超低温区反应4-10秒；进行30-45个循环、在8-15分钟内超短时间内完成核酸扩增检测过程。优选的，所述反应管为聚丙烯PP材质的多聚酶链式反应(PCR)管或玻璃材质的PCR反应管。优选的，所述反应混合液包括聚合酶、扩增引物、dNTP、PCR缓冲液和灭菌双蒸水。本专利技术的第二个目的是公开了一种用于极速核酸扩增方法的反应器，所述反应器包括超高温反应区和超低温反应区；所述超高温反应区的温度调节范围为100℃-150℃中的一个固定温度或温度区间；所述超低温反应区的温度调节范围为10℃-40℃中的一个固定温度或温度区间。优选的，所述超低温反应区和超高温反应区由两块反应管托槽温控金属模块构成，所述两温控金属模块的组装模式为同心圆环、平行条块或齿轮样交叉互嵌方式，所述反应管托槽温控金属模块上设置有反应管孔，所述反应管孔的数量为1-45个，反应管在不同温控模块中可移动以机械手自动完成，在低温时完成荧光检测程序。反应器包括手动、半自动、全自动。优选的，所述反应器包括低温反应环、高温反应盘、隔热带、盖板、旋转轴和步进电机；所述低温反应环和所述高温反应盘同一圆心；所述低温反应环的直径大于所述高温反应盘的直径；所述高温反应盘的外边沿为齿轮样；所述低温反应环的内边沿为齿轮样；所述低温反应环与所述高温反应盘之间用所述隔热带相互分隔并相互咬合形成完整的圆形盘，所述低温反应环与所述高温反应盘咬合处形成齿轮样咬合线；在所述咬合线上沿盘面圆周的同一圆周线上分布样品管孔；样品管孔总数可以为60-90个。所述低温反应环和所述高温反应盘的位置固定；所述盖板与所述旋转轴相连，所述旋转轴的轴心与所述低温反应环或高温反应盘的圆心同圆心；所述盖板通过所述旋转轴与所述步进电机连接；所述低温反应环和高温反应盘位于所述盖板的下方；所述低温反应环的温度设置在10℃-40℃中的一个固定温度或温度区间；所述高温反应盘的温度设置在100℃-150℃中的一个固定温度或温度区间。优选的，所述盖板的侧面周边设置了T型槽开口卡，所述T型槽开口卡与所述样品管孔相对应。优选的，所述样品管孔的底部设置了用于安装激光二极管的孔位；所述低温反应环上的样品管孔设置了用于安装光导纤维的孔位。本专利技术的第三个目的是公开了一种核酸检测设备，所述设备包含上述的反应器。本专利技术的第四个目的是公开了将上述核酸扩增方法用在以PCR为基础的核酸扩增和分析方法中。优选的，上述应用包括实时荧光定量PCR、多重PCR、RT-PCR、巢式PCR和测序等。本专利技术的第五个目的是公开了一种用于上述极速核酸扩增方法的操作系统，包括高温控制部件、低温控制部件和荧光读数控制部件和电脑控制系统，所述电脑控制系统分别与所述高温控制部件、低温控制部件、荧光读数控制部件连接。与现有技术相比，本专利技术的核酸扩增方法对传统核酸扩增进行了革新性的改进，改变了传统PCR三阶段的反应模式，利用了提前固定所需温度、并可批次反应的模式，提出了流水线式的PCR工作模式，提高PCR设备的使用率，节省使用者的时间，实现随来随测，使得系统有更大的灵活性和适用性。采用极端温度差阶以提高温度变化速率，就大大减少了管内反应液达到最适温度所需要的时间，实现了快速核酸检测的目的，使得核酸检测技术能够获得更广泛的应用。附图说明图1显示了长度分别为70bp、100bp、150bp、180bp的扩增片段常规PCR和在100℃和10℃极端环境温度介导的PCR扩增产物电泳结果图，其中，M泳道为分子量标准参照物，泳道1为常规PCR产物电泳结果，泳道2为极端环境温度介导的PCR产物电泳结果；图2显示了长度分别为70bp、100bp、150bp、180bp的扩增片段常规PCR和在130℃和20℃极本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种极速核酸扩增方法，其特征在于，所述方法将装有反应混合液的反应管置于超高温反应区和超低温反应区，进行30‑45个循环；所述超高温反应区的温度为：100℃‑150℃中的一个固定温度；所述超低温反应区的温度为：10℃‑40℃中的一个固定温度；所述循环的程序为：在所述超高温反应区和所述超低温反应区依次放置4‑10秒，作为一个循环。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种极速核酸扩增方法，其特征在于，所述方法将装有反应混合液的反应管置于超高温反应区和超低温反应区，进行30-45个循环；所述超高温反应区的温度为：100℃-150℃中的一个固定温度；所述超低温反应区的温度为：10℃-40℃中的一个固定温度；所述循环的程序为：在所述超高温反应区和所述超低温反应区依次放置4-10秒，作为一个循环。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应管为聚丙烯材质的多聚酶链式反应管或玻璃材质的多聚酶链式反应管；所述反应混合液包括聚合酶、扩增引物、dNTP、PCR缓冲液和灭菌双蒸水。3.一种用于权利要求1所述极速核酸扩增方法的反应器，其特征在于，所述反应器包括超高温反应区和超低温反应区；所述超高温反应区的温度调节范围为100℃-150℃中的一个固定温度或温度区间；所述超低温反应区的温度调节范围为10℃-40℃中的一个固定温度或温度区间。4.根据权利要求3所述的反应器，其特征在于，所述超高温反应区和所述超低温反应区分别由两块反应管托槽温控金属模块构成；所述两块反应管托槽温控金属模块的组装方式为同心圆环、平行条块或齿轮样交叉互嵌方式；所述反应管托槽温控金属模块上有反应管孔，所述反应管孔的数量为1-45个；所述反应管孔内用于放置反应管，所述反应管在所述两块反应管托槽温控金属模块间通过机械手自动完成位置移动；所述反应器设置荧光检测系统，所述荧光检测系统在低温时完成荧光检测程序。5.根据权利要求3所述的反应器，其特征在于，所述超高温反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：周荣，苏晓波，高文娟，李潇，刘文宽，周银华，周志超，许多，
申请(专利权)人：广州市华南医学研究中心，
类型：发明
国别省市：广东,44