The invention discloses a high-throughput screening method for trans-anethole oxygenase mutants and mutant strains and mutants, including using trans-anethole oxygenase gene as template, performing error-prone PCR to obtain trans-anethole oxygenase mutant library, and adding the trans-anethole oxygenase reaction substrate to the library containing trans-anethole oxygenase. Catalytic reaction was carried out in the solution of vanilla oxygenase mutant. The reaction solution was colored with 2,4 dinitrophenylhydrazine, and alkali solution and organic solvent were added to react to determine the absorbance. The invention constructs mutant library by error-prone PCR, and establishes a high throughput screening method based on OD470 determination with 2,4 dinitrophenylhydrazine as chromogenic reagent, and screens mutant strains synthesizing recombinant jasmonaldehyde strains. The method has the advantages of high efficiency, precision and rapidity. The mutant strain LSQ 3 has the advantages of synthesizing jasmonaldehyde and p-jasmonaldehyde. The catalytic efficiency of anisaldehyde and vanillin increased significantly and had good application value.
【技术实现步骤摘要】
一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法及突变菌株和突变体
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法及突变菌株和突变体。
技术介绍
丙烯基苯型精油单分是通过物理的方法从植物精油中提取的某一种丙烯基苯化合物，这类化合物的共同特征是具有丙烯基侧链，并且在苯环上具有甲氧基取代基团，常被作为合成带有苯环结构的名贵香料和药物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化学合成香料在香料生产上存有：香料化合物中残留的化学物质给人体健康带来危害、化学合成会带来环境的污染、化学合成反应立体选择性差而导致产物为外消旋体等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技术越来越受到人们的关注。反式茴香脑加氧酶(TAO)，由Han等人最先在恶臭假单胞菌PseudomonasputidaJYR-1中发现，该酶能氧化反式茴香脑合成对茴香醛，同时也能氧化异丁香酚、异黄樟素和对甲氧基异丁香酚，但催化效率不高，E.coliBL21(DE3)(pET-TAO)在含0.5mmol·L-1的葡萄糖和1mmol·L-1的不同底物溶液中,反应6h，能分别合成0.63mmo...
【技术保护点】
1.一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：包括，以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶突变体文库；将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4‑二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度。
【技术特征摘要】
1.一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：包括，以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶突变体文库；将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度。2.如权利要求1所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：所述易错PCR，包括设计易错PCR引物，所述易错PCR引物为：taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGCtaoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。3.如权利要求1或2所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：所述获得反式茴香脑加氧酶突变体文库，包括以重组质粒PGEX-6P-1-tao为模板，rTaq聚合酶进行易错PCR获得随机突变，PCR体系中添加浓度为7～10mmol·L-1的Mg2+以及30～250μmol·L-1的Mn2+，PCR产物连接至线性质粒PGEX-6P-1，再将连接产物导入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，获得反式茴香脑加氧酶突变体文库。4.如权利要求3所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：所述进行显色反应，包括，将导入感受态细胞的反式茴香脑加氧酶突变体文库涂布平板，挑取单菌落接种于含有100mg·L-1的氨苄青霉素的LB培养基中，诱导培养，离心获得菌体，加入100～200μL的缓冲液混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·L-1的反式茴香脑加氧酶反应底物，28～37℃催化反应20～...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑璞，刘思琴，王玉琴，陈鹏程，闻鹏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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