一种酶催化生产香料的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶催化生产香料的方法，该方法以含有二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳四烯酸(ARA)等多不饱和脂肪酸为主要成分的鱼油为原料，利用一种具有氢过氧化物裂解功能的脂氧合酶为酶反应工具，一步完成对鱼油水解产物的氧化裂解反应，高效、快速地获得多种具有天然香味的香料化合物。

【技术实现步骤摘要】
一种酶催化生产香料的方法
本专利技术涉及一种香料的生产方法，尤其涉及一种采用酶催化生产香料的方法，属于生物香料生产

技术介绍
近年来，人们对风味物质的需求逐渐增加。如2E-或3Z-己烯醛、3-或2-壬烯醛和3、6-或2、6-壬二烯醛是植物特有香气的主要成分。它们被广泛作为一类食品香气添加剂来重建水果和蔬菜加工中丢失的“鲜绿”香气。2-壬烯醛是一种木香型食用香料，极低浓度时表现出很好的香气和香味特征，可以加到天然或合成增香的食品中，例如肉、咖啡及其它饮料，改善或增强了香气性质，使得食品的香味和香气比天然物还浓，广泛用于调配日化香精和食用香精，尤其对于增强咖啡香味食品的香气效果极佳。1-辛烯-3-醇具有蘑菇香味和强烈的壤土香及药草香韵，也是香料行业中一种有价值的合成香料。但这些风味物质在植物中的含量有限，从天然物中提取的成本较高，加之人们对绿色化学品的要求使得在食品风味料生产中尽量少采用化学合成法，因而利用生物合成法外源催化合成风味物质成为一条经济可行、逐渐被重视的路线。如利用大豆脂肪氧合酶结合植物氢过氧化物裂解酶与面包酵母，形成了一条经济、可行、有效、环境友好的工业化生产路线，生产天然清香味化合物的工艺。利用该法可得到1-己醇、顺-3-己烯-1-醇等物质。以红花油、亚麻籽油为原料，利用脂肪氧合酶和氢过氧化物裂解酶联合生产六碳和九碳的醛类物质。由于酶法催化的环保、安全性，现已越来越多被开发使用。但是，目前都是使用双酶联用或者粗酶提取物方法进行，同时带来了酶反应体系不好控制、产物得率有所降低等不良现象。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是另提供一种酶催化生产香料的方法，该方法生产的香料具有天然香味。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种酶催化生产香料的方法，其特征在于包括如下步骤：1)将浓度为25～250mg／mL的鱼油水解物加入至浓度为25～50mg／L的双活性脂氧合酶蛋白溶液中，鱼油水解物与双活性脂氧合酶蛋白溶液的体积比为1：100～150，于18～22℃下避光震荡反应1～2h，得到反应液，反应液中水解物的浓度为300～2500mg／L；2)上述反应液用乙醚萃取，乙醚与反应液的体积比为1：0.8～1.2，萃取获得的有机相用无水硫酸镁干燥，于20～25℃蒸发浓缩，获得香料。步骤2)中所述乙醚萃取方法为：向反应液中加入乙醚，乙醚与反应液的体积比为1：0.8～1.2，于4～10℃避光震摇15～30min，离心处理5～15min，转速为6000～10000rpm，收集上层有机相，并对下层相重复抽提至1～2次，合并有机相，加入1～100g无水硫酸镁干燥。所述鱼油为含有多聚不饱和脂肪酸的食用鱼油、饲料鱼油或深海鱼油，所述多聚不饱和脂肪酸为二十碳四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。获得的所述香料为C-8、C-9、C-10的烯醛和烯醇类物质。所述鱼油水解物按照100～25mg：1ml比例将鱼油加入溶液A中，得到溶液B，溶液A为浓度为5～7wt％的KOH-甲醇水溶液，溶液A中，甲醇与水的体积比为3.8～4.2：1，向溶液B中充氮气1min后55～65℃水浴1～2h，冷却后用18～22wt％HCl调节pH至小于1，得到溶液C，再用25～35mL体积比为1：3.8～4.2的氯仿／正己烷混合液分多次进行抽提，离心后取上层有机相进行室温旋转蒸发后，加1～4mL甲醇进行溶解，得鱼油水解物。最后，所述双活性脂氧合酶蛋白溶液为双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本方法利用鱼油作为原料，通过与具有氢过氧化物裂解酶功能的脂氧合酶的一步催化反应，生产多种具有天然香味的香料，这类香料物质主要涉及C-8，C-9，C-10的醛类和醇类物质等。本方法所用原料来源丰富、成本低，且反应条件温和，生产效率高、快速，无有害物质产生，可同时获得多种具有天然风味的香料。本方法将为香料工业开辟一条高效、快速生产烯醛类具有天然风味香料的新途径，并为食品添加剂工业和日化工业提供新的物质基础。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1：双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液的制备采用TakaraRNAisoPluskit(Takara，日本)，以trizol法提取坛紫菜叶状体的总RNA。采用TakaraprimescriptRTreagentkit(Takara，日本)，对提取的坛紫菜叶状体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。以此cDNA为模板，用一对带NdeI／HindIII酶切位点的特异性引物扩增PhLOX基因的完整ORF，引物序列如下：正向引物：5′GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3′反向引物：5′CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3′。克隆的目的片段首先连接到pMD-18T(Takara，日本)上形成LOX-18T的重组克隆载体，通过转化E.coliDH5α进行测序，以检测目的片段的编码正确性。选择pET-28a(Takara，日本)为表达载体，在每40μL体系中，取LOX-18T和pET-28a空载体各１μg并各自用2U的NdeI／HindIII(BioLabs，英国)进行双酶切，37℃孵育2h以上。取5μL酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，待质粒酶切完全后进行割胶回收和定量。在每20μL体系中，将回收的目的片段和表达载体按135ng／50ng的比例进行连接，采用1U的T4连接酶(Fermentas，美国)在4℃下连接过夜，以构建重组质粒LOX-28a。取所有连接液，与100μL感受态E.coliBL21(Takara，日本)快速混匀，冰中预冷30min，后42℃水浴热激90s，热激后立即插在冰中，以构建重组体系LOX-28a-BL21。冰浴5min后加入800μL、4℃预冷的LB液体培养基，37℃下200r／min摇菌2h。后取100μL菌液均匀涂布在含50μg／mL卡那霉素(Kana+)的LB固体平板上。平板倒扣放置在37℃下避光培养12h～16h，用10μL无菌移液枪头将肉眼可见的乳白色菌落挑取并溶解于20μL、含50μg／mL卡那霉素的LB液体培养基中。取1μL该菌液作为模板，用上述带NdeI／HindIII酶切位点的特异性引物进行PCR检测，检测程序同表1，PCR体系同表2。取5μL该PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测其对应菌液的真阳性，后将剩余19μL菌液转移至5mL的LB+Kana+(50μg／mL)液体培养基中扩大培养，37℃、200r／min、12h。取1mL菌液送测序以确定重组载体的编码正确性，得到的真阳性克隆体LOX-28a-BL21。表1PhLOX的PCR检测程序表2PhLOX的PCR扩增体系将克隆体LOX-28a-BL21于300mL的LB+Kana+(50μg／mL)液体培养基中扩大培养至OD600=0.6，37℃、250r／min，后加0.1mMIPTG诱导表达。诱导条件为20℃，100rpm，16h。诱导完成后，以5000rpm，4℃，15min离心收集菌体。去上清培养液，再用10mL细胞裂解液bufferA-II(50mMTris-HCl，pH8.0，200mMNaCl，10％(v／v)gl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶催化生产香料的方法，其特征在于包括如下步骤：1)将浓度为25～250mg／mL的鱼油水解物加入至浓度为25～50mg／L的双活性脂氧合酶蛋白溶液中，鱼油水解物与双活性脂氧合酶蛋白溶液的体积比为1：100～150，于18～22℃下避光震荡反应1～2h，得到反应液，反应液中水解物的浓度为300～2500mg／L；2)上述反应液用乙醚萃取，乙醚与反应液的体积比为1：0.8～1.2，萃取获得的有机相用无水硫酸镁干燥，于20～25℃蒸发浓缩，获得香料。

【技术特征摘要】
1.一种酶催化生产香料的方法，其特征在于包括如下步骤：1)将浓度为25～250mg/mL的鱼油水解物加入至浓度为25～50mg/L的双活性脂氧合酶蛋白溶液中，鱼油水解物与双活性脂氧合酶蛋白溶液的体积比为1:100～150，于18～22℃下避光震荡反应1～2h，得到反应液，反应液中水解物的浓度为300～2500mg/L；2)上述反应液用乙醚萃取，乙醚与反应液的体积比为1:0.8～1.2，萃取获得的有机相用无水硫酸镁干燥，于20～25℃蒸发浓缩，获得香料；所述双活性脂氧合酶是从坛紫菜提取的；所述双活性脂氧合酶蛋白溶液为双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液；所述双活性脂氧合酶，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述鱼油为含有多聚不饱和脂肪酸的食用鱼油、饲料鱼油或深海鱼油，所述多聚不饱和脂肪酸为二十碳四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱竹君，陈海敏，严小军，骆其君，杨锐，陈娟娟，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33