悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法技术

悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，是一种利用细胞培养反应器培养金线莲细胞来生产金线莲生物碱的方法。本方法首先对金线莲种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中未分化的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块生长，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。本发明专利技术能够大幅度缩短细胞培养周期，提高金线莲生物碱产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物碱生产技术，尤其涉及金线莲生物碱的生产技术，具体为一种采用细胞培养法生产金线莲生物碱的方法。
技术介绍
金线莲生物碱类化合物是金线莲的主要成分之一，金线莲对支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎、急慢性肝病、高血压、动脉硬化、脑血栓等均有辅助功效。金线莲生物碱的药理作用主要表现在消炎、解毒、护肝、预防心血管疾病的作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统金线莲生物碱的提取方法是用金线莲属植物的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对金线莲精深加工的需求。 随着植物细胞工程技术的发展，用细胞进行人工培养扩增提取植物的代谢产物，可以不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞工程技术生产金线莲生物碱的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。关于利用气升搅拌罐悬浮培养金线莲细胞生产金线莲生物碱的研究还没有报道，因此开发一种高效生产金线莲生物碱类天然产物的方法是十分有意义的。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供一种利用气升搅拌罐，以解决上述
技术介绍
中的研究空白。 本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现，，是一种利用细胞培养反应器培养金线莲单细胞系群来生产金线莲生物碱的方法，培养基中添加植物生长调节剂和生物酶制剂来激活细胞生长并缩短细胞培养周期，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。具体步骤见如下阐述:(O单细胞制备取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用50-80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；(2)单细胞系培养:将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养；(3)细胞群放大培养: 将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵耀中，培养基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.l-2mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6_节氛基嘿呤)0.l_2mg/L,中性果胶酶50-100mg/L,中性纤维素酶10-50mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持PH在5.6±4;(4)当细胞密度达到60000-80000个/ml即可停止培养，时间为15-18天，采用低速离心或其他方法收集金线莲细胞，再常规方法提取金线莲生物碱。 本专利技术工艺技术优点本专利技术中，首先对金线莲种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧供应均匀、充分，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。本专利技术能够大幅度缩短细胞培养周期，提高产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。 【具体实施方式】 根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制本专利技术的权利要求，在不脱离本专利技术精神和范围的前提下，本专利技术还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本专利技术范围内。 具体实施例11、培养阶段(1)单细胞制备取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；(2)单细胞系培养将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到10000个/mL，即可放大培养；(3)细胞群放大培养 将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵耀中，培养基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.5mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine,6-节氨基嘌呤)0.5mg/L,中性果胶酶50mg/L,中性纤维素酶10mg/L，鲜细胞接种量为30g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;(4)当细胞密度达到60000个/ml即停止培养,时间15天,采用100rpm低速离心收集金线莲细胞，将收集到的金线莲细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用; 2、提取阶段(1)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90%的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱；(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300?，时间为15min，最终形成悬浊液，将悬浊液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.019g，收率为 0.39%0。 具体实施例21、培养阶段(O单细胞制备取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用60微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；(2)单细胞系培养将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为40g/L，光强度为20001ux，色温为6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到20000个/mL，即可放大培养；(3)细胞群放大培养 将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵耀中，培养基中加入:NAA (1-Naphthalen本文档来自技高网...

【技术保护点】
悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，其特征在于，是一种利用细胞培养反应器对金线莲细胞培养，添加植物生长调节剂和生物酶制剂激活细胞生长并缩短细胞培养周期，来生产金线莲生物碱的方法，具体步骤为： （1）单细胞制备取金线莲蒴果消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；（2）单细胞系培养将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为1000‑3000lux，色温为4000‑6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2℃，当细胞密度达到10000‑20000个/mL，即可放大培养；（3）细胞群放大培养 将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵罐中，培养基中加入：NAA 0.1‑2mg/L，6‑BA 0.1‑2mg/L，果胶酶50‑100mg/L，纤维素酶10‑50mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为1000‑3000lux，色温为4000‑6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4； （4）当细胞密度达到60000‑80000个/ml 即可停止培养，时间为15‑18天，采用低速离心或过滤法收集金线莲细胞，再常规方法提取金线莲生物碱。...

【技术特征摘要】
1.悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，其特征在于，是一种利用细胞培养反应器对金线莲细胞培养，添加植物生长调节剂和生物酶制剂激活细胞生长并缩短细胞培养周期，来生产金线莲生物碱的方法，具体步骤为: (1)单细胞制备 取金线莲蒴果消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞,并离心过滤除杂,收集单细胞； (2)单细胞系培养 将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25土2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓辉，陈乃富，刘文中，陈存武，韩邦兴，余茂耘，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34