一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法技术

本发明专利技术属于海洋药物、酶工程学及天然产物分析技术领域，公开了一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，包括以下步骤：1.对COX‑2酶进行固定化；2.测定固定化COX‑2酶的酶活力；3.建立抑制剂对固定化COX‑2酶抑制活性的评价体系；4.筛选COX‑2的天然产物抑制剂；5.评价天然产物的固定化COX‑2酶抑制效果；6.评价可重复利用性。本技术方案条件温和，简单有效；固定化酶在海洋生物复杂基质中进行实际样品筛选，重复使用5次仍就能保持80%以上的酶活力，且可以通过离心快速方便的进行回收再利用；利用固定化COX‑2酶对海洋天然产物粗提物进行了潜在抑制剂筛选，发现黄海葵和柄海鞘均与COX‑2酶有亲和结合能力，可成为潜在的天然药物来源。

A method for rapid evaluation of activity inhibition of cyclooxygenase 2 in marine natural products based on immobilized enzyme

The invention belongs to the field of marine medicine, enzyme engineering and natural product analysis technology, and discloses a method for rapid evaluation of cyclooxygenase 2 activity inhibition of marine natural product based on immobilized enzyme, including the following steps: 1. immobilization of COX 2 enzyme; 2. determination of enzyme activity of immobilized COX 2 enzyme; 3. establishment of inhibitor pairs; The evaluation system of the inhibitory activity of immobilized COX_2 enzyme; 4. Screening the natural product inhibitors of COX_2; 5. Evaluating the inhibitory effect of immobilized COX_2 enzyme of natural products; 6. Evaluating the reusability. The technical scheme is mild, simple and effective; the immobilized enzyme can retain more than 80% of the enzyme activity in the complex matrix of marine organisms after five times reuse, and can be quickly and conveniently recycled by centrifugation; the immobilized COX_2 enzyme has potential for the crude extract of marine natural products. Inhibitor screening showed that both Anemone flavescens and Scutellaria pedunculata had affinity to COX 2 enzyme and could be potential natural drug sources.

【技术实现步骤摘要】
一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法
本专利技术属于海洋药物、酶工程学及天然产物分析
，尤其涉及一种快速筛选天然产物中COX-2抑制剂的方法，具体地说，涉及利用固定化酶技术与色谱、质谱联用技术从天然产物提取物中快速筛选COX-2酶抑制剂的方法。
技术介绍
COX是一种催化AA生成PGs的血红素酶。许多组织中存在的PGs会引起炎症和疼痛。AA产生的PGs主要由COX-2酶催化，这是一种诱导型的COX同工酶，在炎症和肿瘤形成中起重要作用。COX-2酶还可以作用于中枢神经引起痛觉过敏，并与肾病的发生有关。由于选择性地抑制COX-2酶不仅避免了与COX-1酶抑制相关的主要副作用，而且保留了经典的非甾体抗炎药物的所有优点，因此该酶已成为发现和发展抗炎或抗肿瘤药物的重要药物靶点。在过去的几十年中，发现COX-2选择性抑制剂的技术，包括HPLC、LC-MS、超滤LC-MS、虚拟筛选方法、生物分析等，得到了越来越多的报道。其中一些方法使用培养的细胞系，不仅耗时，还需要特殊的实验技能。由于使用纯化或重组酶的检测比基于细胞的检测更简单、更方便和更省时，所以最近扩大了用于筛选COX-2选择性抑制剂的商业化纯化或重组COX-2的用途。然而，在商业上提供的COX-2仍然非常昂贵，而且成本可能是限制体外检测方法进一步应用于筛选COX-2选择性抑制剂的核心瓶颈。用固定化的COX-2代替游离的COX-2是克服游离酶在体外筛选COX-2选择性抑制剂的成本高、不可回收等缺点的关键。与游离酶相比，固定化酶具有许多优点，包括可重复利用性、长时间储存、低成本、更适宜的pH和温度等。固定化酶的稳定性随着多点或多亚基固定化的发生而增加。此外，固定化酶的选择性和特异性在不同的实验条件下也有很大的差异。为了通过固定化来改善酶的性质，需要开发新的固定化系统(如新材料、改进的应用、可视化技术等)，以及对酶与活性固体相互作用机理的深入了解。基于靶配体结合作用的亲和固定化技术的应用已经逐渐成熟。固定化最简单、最温和的耦合方法之一是通过GA与水不溶性载体共价结合，在水缓冲液中进行反应，因为该缓冲液提供了接近生理pH、离子强度和温度的条件。海洋药物，因其特殊的生长环境，如高盐、高压、寡营养盐、低温，但相对恒温（火山口附近有高温、极地地区还有超低温）以及有限的光照和缺氧等，以及生物的多样性，其次生代谢产物与陆源生物有极大不同，其中不乏结构新颖、功能独特的天然活性成份。然而，传统海洋天然产物化学研究方法存在活性物质发现效率低、操作繁琐、样品制备困难、常见化合物重复分离和制备以及评价方法耗时耗力等问题，制约了海洋天然产物中有效成分的快速筛选。因此，发展适用于海洋天然产物活性物质快速发现的新方法势在必行。AA（arachidonicacid）：花生四烯酸；APS（aminopropyltrimethoxysilane）：氨丙基三甲基硅烷；COX（cyclooxygenase）：环氧合酶；COX-2（cyclooxygenase-2）：环氧合酶2；DMSO（dimethylsulfoxide）：二甲基亚砜；EIC（extractedionchromatography）：提取离子色谱图；FESEM（Field-EmissionScanningElectronMicroscope）：场发射扫描电子显微镜；HPLC-IT-MS（highperfomanceliquidchromatography）：高效液相色谱；HPLC-IT-MS（highperfomanceliquidchromatography-iontrap-massspectrometry）：高效液相色谱离子阱质谱法；LC-MS（liquidchromatography-massspectrometry）液相色谱质谱法；PBS（phosphatebuffersaline）：磷酸缓冲液；PGs（prostaglandins）：前列腺素类化合物；PGE2（prostaglandinE2）：前列腺素E2。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述技术问题，克服海洋天然产物筛选过程中现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速评价天然产物中COX-2酶活性抑制的方法，可用于筛选海洋天然产物提取物具有抗炎抗肿瘤作用的COX-2的亲和抑制剂。本专利技术海洋天然产物对COX-2酶体外抑制作用的评价是指海洋天然产物提取物与固定化COX-2酶进行孵化和结合后，酶催化底物AA能力下降，使产物PGE2的生成量减少，通过计算PGE2的浓度变化来判断海洋天然产物对COX-2酶的抑制率，包括以下步骤：COX-2酶抑制剂是海洋天然产物提取物；步骤一：对SiO2微球进行活化，并用硅烷偶联剂在微球表面实现氨基化功能基团的修饰。利用表面氨基修饰的APS-Si微球作为载体，通过GA交联剂与COX-2酶之间的共价结合作用进行固定化。步骤二：利用HPLC-IT-MS联用技术测定固定化COX-2酶的酶活力。步骤三：以HPLC-IT-MS联用技术为检测手段建立抑制剂对固定化COX-2酶抑制活性的评价体系。步骤四：利用步骤三建立的活性抑制评价体系，筛选COX-2的天然产物抑制剂。步骤五：对天然产物的固定化COX-2酶抑制效果进行评价。步骤六：对固定化酶在海洋药物复杂体系中的可重复利用性进行考察。本专利技术的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物COX-2酶活性抑制的方法，步骤一中SiO2微球的活化试剂为HCl。硅烷偶联剂为APS。步骤一中固定化方法为GA共价结合固定法。交联剂GA用量为0.013%-0.5%（w/w）。所用COX-2酶为商业购置的人重组蛋白酶，浓度为5-30U。固定化pH为6.0-8.0，固定化温度为10-37℃，固定化时间为4-24h。步骤二中底物AA浓度为1.5-10mg/L，固定化酶用量为0.4-2U，反应时长为2-50min。步骤三中采用HPLC-IT-MS进行检测，以indomethacin和celecoxib作为阳性对照品，以rutin作为阴性对照品验证筛选模型。步骤四中评价体系应用于海洋天然产物粗提物中进行抑制效果分析，筛选出对COX-2酶有效抑制的海洋生物粗提物。柄海鞘和黄海葵作为潜在的海洋天然产物对COX-2酶有不同的抑制效果。固定化酶的制备方法中，COX-2酶通过席夫碱反应以共价键合的形式固定于表面氨基修饰的APS-Si微球表面。本专利技术的另一个目的是提供用上述方法制备的固定化COX-2酶并运用于潜在抑制剂筛选，通过该方法制备的固定化酶在4℃的保存稳定性较游离酶有很大提高，且通过离心可以快速方便的回收再利用。随后利用固定化COX-2酶对不同的海洋天然产物粗提物进行潜在抑制剂的筛选，并在所建评价体系条件下测试固定化COX-2酶在实际筛选过程中的重复利用性。结果发现，再重复使用5次后，固定化酶仍能保持80%的酶活力。本专利技术的有益效果：（1）固定化COX-2酶的制备方法为席夫碱共价结合法，条件温和，简单有效，采用的载体为表面氨基修饰的APS-Si微球，具有很高的潜在研究价值。（2）固定化酶在海洋生物复杂基质中进行实际样品筛选，重复使用5次仍就能保持80%以上的酶活力，且可以通过离心快速方便的进行回收再利用。（3）利本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：对COX‑2酶进行固定化；步骤二：测定固定化COX‑2酶的酶活力；步骤三：建立抑制剂对固定化COX‑2酶抑制活性的评价体系；步骤四：筛选COX‑2的天然产物抑制剂；步骤五：评价天然产物的固定化COX‑2酶抑制效果；步骤六：评价可重复利用性。

【技术特征摘要】
1.一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：对COX-2酶进行固定化；步骤二：测定固定化COX-2酶的酶活力；步骤三：建立抑制剂对固定化COX-2酶抑制活性的评价体系；步骤四：筛选COX-2的天然产物抑制剂；步骤五：评价天然产物的固定化COX-2酶抑制效果；步骤六：评价可重复利用性。2.根据权利要求1所述的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于：步骤一中的固定化方法为对SiO2微球进行活化，并在表面实现氨基化功能基团的修饰，利用表面氨基修饰的APS-Si微球作为载体，通过GA交联剂与COX-2酶之间的共价结合作用进行固定化。3.根据权利要求2所述的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于：SiO2微球的活化试剂为HCl，硅烷偶联剂为APS。4.根据权利要求3所述的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于：交联剂为GA，用量为0.013%-0.5%（w/w），COX-2酶为人重组蛋白酶，浓度为5-30U，固定化pH为6.0-8.0，固定化温度为10-37℃，固定化时间为4-24h。5.根据权利要求1-4任一所述的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于：步骤二是利用HPLC-IT-MS联用技术测定固定化COX-2酶的酶活力。6.根据权利要求5所述的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于：测定酶活力时，底物花生四烯酸（AA）浓度为1.5-10mg/L，固定化酶用量为0.4-2U，反应时长为2-50min。7.根据权利要求1-4或6任一所述的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法，其特征在于：步骤三是以HPLC-IT-MS联用技术为检测手段建立抑制剂对固定化COX-2酶抑制活性的评价体系。8.根据权利要求7所述的一种基于固定化酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：史倩，陈军辉，郑立，
申请(专利权)人：山东省科学院海洋仪器仪表研究所，国家海洋局第一海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37