人β-防御素2的新用途及其制备方法技术

本发明专利技术公开了人β‑防御素2的新用途及其制备方法，本发明专利技术提出了人β‑防御素2在制备治疗真菌尤其是丝状真菌感染性疾病药物中的应用。本发明专利技术提供了重组人β‑防御素2多肽的制备方法，将HBD2成熟肽基因插入pET32a(+)质粒，将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌获得表达工程菌，诱导培养表达工程菌表达HBD2融合蛋白，最后再通过镍亲和层析、凝血酶酶切、纯化、浓缩获得重组人β‑防御素2多肽。本发明专利技术中提出了人β‑防御素2的新用途。本发明专利技术中的方法具有造价低廉、产量多且容易保证多肽的生物学活性的特点。

New uses and preparation methods of human beta defensin 2

The invention discloses a new use of human beta defensin 2 and a preparation method thereof. The invention provides the application of human beta defensin 2 in the preparation of medicines for treating fungi, especially filamentous fungal infectious diseases. The invention provides a preparation method of recombinant human beta defensin 2 polypeptide, inserts HBD2 mature peptide gene into pET32a (+) plasmid, transfers the correct recombinant plasmid into E.coli to obtain expression engineering bacteria, induces culture and expression engineering bacteria to express HBD2 fusion protein, and finally through nickel affinity chromatography, thrombin digestion, purification and concentration. The recombinant human beta defensin 2 polypeptide was obtained. The invention provides a new use of human beta defensin 2. The method of the invention has the characteristics of low cost, high yield and easy guarantee of the biological activity of the polypeptide.

【技术实现步骤摘要】
人β-防御素2的新用途及其制备方法
本专利技术涉及一种活性小分子蛋白质的新用途及其制备方法，特别是人β-防御素2的新用途及其制备方法。
技术介绍
近年来，随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛应用，以及AIDS的蔓延、器官移植和介入技术的推广应用，使真菌感染的发病率呈现上升趋势，2014年的真菌感染率为20世纪90年代的数倍，念珠菌属和曲霉属是目前最常见的真菌感染的病原菌，某些真菌引起的系统性感染致死率高达90％。对于艾滋病患者(AIDS)，真菌感染是最常见的机会性感染，其发病率和死亡率均较高。虽然不同作用机制的抗真菌药物在治疗真菌感染中发挥了重要作用，但随着感染菌种逐渐发生变化，有关耐药菌株的报道逐渐增多，使得真菌感染的治疗面临着严峻的挑战。人β-防御素广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内，包括皮肤、呼吸道、尿道、肠道和口腔粘膜上皮细胞等。关于人β-防御素的抗微生物活性，已证实人工合成的人β-防御素具有抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的作用。但关于人β-防御素2抗丝状真菌的作用未见相关报道。人工合成的人β-防御素，造价昂贵、产量少且不易保证多肽的生物学活性。目前，已经运用生物信息学方法发现了大约30种人β-防御素基因。β-防御素的基因上游启动子有前NF-κB、IL-6和STAT等的结合位点，当病原体相关模式分子(PAMP)与上皮细胞表面的模式识别受体(包括CD14，TLRs等)结合后，在多种促炎因子(TNF-α，IL-1)参与下，激活NF-κB等转录因子，再与启动子区的NF-κB、IL-6结合位点结合，使其基因激活并转录和翻译，属于诱导性表达。因此，现有技术中未发现人β-防御素2抗真菌相关的应用，尤其是抗丝状真菌相关的应用。现有的人β-防御素2的合成方法，存在造价昂贵、产量少且不易保证多肽的生物学活性的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的，是提供人β-防御素2的新用途及其制备方法。本专利技术提出了人β-防御素2在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用，尤其是在制备治疗丝状真菌感染性疾病药物中的应用。本专利技术提供了一种重组人β-防御素2多肽(recombinanthumanbeta-defensin2,rHBD2)的制备方法。本专利技术中重组人β-防御素2多肽的制备方法具有造价低廉、产量多且容易保证多肽的生物学活性的特点。本专利技术的技术方案：人β-防御素2的新用途，人β-防御素2在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用。前述的人β-防御素2的新用途中，所述真菌感染性疾病为丝状真菌感染性疾病。前述的人β-防御素2的新用途中，所述的人β-防御素2为重组人β-防御素2多肽。前述的人β-防御素2的新用途中，取人β-防御素2，加入一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，制备成各种治疗真菌感染的药物制剂。前述的人β-防御素2的新用途中，所述的治疗真菌感染的药物制剂为口服制剂：片剂、胶囊剂、口服液、混悬液；或者注射制剂：可注射的溶液、混悬液、粉针剂；或者外用制剂：乳膏剂或溶液。前述的人β-防御素2的新用途中，所述重组人β-防御素2多肽的制备方法，根据genbank提供的HBD2基因序列，合成HBD2成熟肽基因；将HBD2成熟肽基因插入pET32a(+)质粒；将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌Rossetta-gami(2)，获得表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2；诱导培养表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2表达HBD2融合蛋白，收集菌细胞内容物；通过镍亲和层析将细胞内容物中的HBD2融合蛋白纯化，利用凝血酶酶切HBD2融合蛋白中由pET32a(+)质粒所赋予的标签蛋白，再经镍亲和层析纯化、脱盐、浓缩获得重组人β-防御素2多肽。前述的重组人β-防御素2多肽的制备方法中，所述HBD2成熟肽基因插入pET32a(+)质粒，是先将HBD2成熟肽基因和pET32a(+)质粒用BamHⅠ和XholⅠ分别进行酶切反应，再在T4DNA连接酶的作用下将酶切后的HBD2成熟肽基因和酶切后的pET32a(+)进行连接反应。前述的重组人β-防御素2多肽的制备方法中，所述连接反应中，酶切后的HBD2成熟肽基因与酶切后的pET32a(+)质粒的分子摩尔数比为(3～10):1。前述的重组人β-防御素2多肽的制备方法中，所述表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2经IPTG诱导表达HBD2融合蛋白。前述的重组人β-防御素2多肽的制备方法中，所述工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2表达HBD2融合蛋白，最优表达条件为,最佳IPTG浓度为0.5mM，最佳诱导时间为6h，最佳温度为34℃。与现有技术比较，本专利技术得出人β-防御素2可破坏菌细胞结构，对单细胞真菌和多细胞真菌均具有抑制或杀灭作用。本专利技术提出了人β-防御素2在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用，尤其是在制备治疗丝状真菌感染性疾病药物中的应用，扩大了人β-防御素2的应用范围。本专利技术提供了一种人β-防御素2(重组人β-防御素2多肽)的制备方法。该制备方法将HBD2成熟肽基因插入pET32a(+)质粒，将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌Rossetta-gami(2)获得表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2，诱导培养表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2表达HBD2融合蛋白，最后再通过镍亲和层析、凝血酶酶切、纯化、浓缩获得重组人β-防御素2多肽(recombinanthumanbeta-defensin2,rHBD2)。本专利技术为人β-防御素2多肽的制备提供了新途径。该制备方法具有造价低廉、产量多且容易保证多肽的生物学活性的特点。附图说明图1为pET32a(+)质粒结构示意图；图2为pET32a(+)/HBD2原核重组质粒结构示意图；图3为pET32a(+)/HBD2重组质粒的双酶切鉴定结果，图中的标记为：1-pET32a(+)/HBD2重组质粒(未酶切)，2-pET32a(+)/HBD2重组质粒Xhol和Apal双酶切产物，3-DNA标准分子量Marker；图4为pET32a(+)/HBD2重组质粒的测序结果；图5为HBD2融合蛋白诱导表达SDS-PAGE凝胶电泳结果，图中的标记为：1-蛋白质标准分子量Marker，2-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2诱导产物，3-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2未诱导产物；图6为HBD2融合HBD2蛋白的WesternBlot鉴定结果，图中的标记为：1-蛋白质标准分子量Marker，2-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)未经IPTG诱导，3-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2经IPTG诱导；图7为重组HBD2多肽的SDS-PAGE电泳结果，图中的标记为：M-蛋白质标准分子量Marker，1-酶切产物穿透液，2-BindingBuffer洗柱的穿透液，3-Elutionbuffer洗脱液的穿透液，4-酶切产物；图8为重组HBD2多肽的WesternBlot鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人β‑防御素2的新用途，其特征在于：人β‑防御素2在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.人β-防御素2的新用途，其特征在于：人β-防御素2在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的人β-防御素2的新用途，其特征在于：所述真菌感染性疾病为丝状真菌感染性疾病。3.根据权利要求1或2所述的人β-防御素2的新用途，其特征在于：所述的人β-防御素2为重组人β-防御素2多肽。4.根据权利要求3所述的人β-防御素2的新用途，其特征在于：取人β-防御素2，加入一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，制备成各种治疗真菌感染性疾病药物制剂。5.根据权利要求3或4所述的人β-防御素2的新用途，所述重组人β-防御素2多肽的制备方法，其特征在于：根据genbank提供的HBD2基因序列，合成HBD2成熟肽基因；将HBD2成熟肽基因插入pET32a(+)质粒；将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌Rossetta-gami(2)，获得表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2；诱导培养表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD2表达HBD2融合蛋白，收集菌细胞内容物；通过镍亲和层析将细胞内容物中的HBD2融合蛋白纯化，利用凝血酶酶切HBD2融合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：江滟，沈祥春，杨红宇，易旭，罗红，兰露莎，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52