一种靶向筛选外源基因双整合位点提高人C5单抗表达产量的方法技术

本发明专利技术提供了一种以靶向筛选外源基因双整合位点提高人C5单抗表达产量的方法，包括：(1)将人补体C5抗体的轻、重链编码基因分别插入两个真核表达载体；(2)获得重组轻、重链编码质粒并共转染至中国仓鼠(CHO)DG44细胞；(3)用FISH技术筛选轻、重链编码基因双整合定位在染色体1q1和1q13的细胞克隆。本发明专利技术筛选获得的1q1和1q13区支持轻、重链编码基因的强转录，可实现人C5单克隆抗体在CHO‑DG44细胞中的高效和稳定表达，其产物可用于治疗因C5水平升高而受累的各种疾病。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向筛选外源基因双整合位点提高人C5单抗表达产量的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种靶向筛选双整合位点提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法。
技术介绍
人C5单克隆抗体(“Soliris”，也称为依库株单抗)先后被批准用于“阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)”和“非典型溶血尿毒综合征(aHUs)”。其它适应症如“难治性重症肌无力”已完成临床试验，“复发性视神经脊髓炎谱系疾病”和“抗体介导的排斥反应”也已进入临床试验的后期阶段。依库珠单抗是目前全球最昂贵的药物，除了因治疗疾病的特殊定价外，早期生物技术和重组蛋白表达体系制约了抗体的表达产量，也是导致该药成本偏高的重要因素。中国目前尚无生产依库株单抗的企业，进口药的昂贵价格尚不能满足中国患者逐年增加的临床需求，同时也需要低成本药物的生产方法。宿主细胞自身遗传稳定性，如宿主染色体或基因组变异(位置效应)是导致重组蛋白表达差异变化的重要原因。表达治疗性重组蛋白的生产用细胞系大多为CHO细胞及其亚型，包括CHO-K1、CHO-S和DG44等，这些细胞有共同的遗传特征，即染色体非整倍性，大约为18-21条染色体，且只有1号染色体保留了成对性和正常基因组，其余染色体则因频繁的重排致基因组变异或丢失，直接影响其转录活性。外源基因通常是随机整合至宿主染色体，通过非靶向性筛选获得的表达体系其产量低，持续表达的稳定性也较差。研究发现，外源基因整合在大的染色体较整合至小染色体具有产物表达优势。应用CHO-DUK细胞表达人促红细胞生成素(Epo)的研究发现，Epo编码基因在大染色体(包括1和2号染色体)上整合表现出高产蛋白特征，而在其它染色体，尤其小染色体上整合则引起重组蛋白表达不稳定或低产量表达(Lattenmayer等,Cytotechnology.2006；51:171–182)。我们最近用染色体荧光原位杂交(FISH)技术发现，外源基因在1号染色体1q12-13位点整合的CHO-S细胞系，其表达重组蛋白的产量明显高于整合于其它染色体位点的细胞系，且持续表达也十分稳定(Li等,PLoSOne.2016；11:e0163893)。由此提示：CHO细胞及其亚型细胞的大染色体尤其整合至1号染色体，可能是外源基因整合的最佳靶位点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服外源基因随机整合的不足，提供一种靶向筛选双整合位点在DG44细胞染色体1q1和1q13区域的抗体轻、重链编码基因，进而提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法。一种靶向筛选双整合位点在染色体1q1和1q13区域的抗体轻、重链编码基因，进而提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法，其包括如下步骤：(1)将人C5单克隆抗体的轻、重链编码基因分别插入包含“UCOE”的两个真核表达载体的多克隆位点，获得重组表达质粒；(2)将步骤(1)获得的重组表达质粒共转染至CHO-DG44细胞，经MTX浓度梯度加压筛选，获得表达C5单克隆抗体的重组细胞群；(3)将重组细胞群以500细胞/ml接种于半固体培养基(6孔培养板)，待细胞逐渐长至肉眼可见的集落时(大约2周)，挑取单集落细胞至96孔板培养，之后逐渐转移至48孔板、24孔板和6孔板培养；(4)单集落细胞按照步骤(4)进行第二轮筛选，挑取单克隆细胞，经扩大培养后，常规制备染色体；(5)同步采用PCR技术分别扩增含轻、重链编码基因的重组质粒，用于轻、重链探针的制备和标记；(6)将染色体和探针进行荧光原位杂交(FISH)，确定单克隆细胞中轻、重链编码基因在染色体上的整合位点；(7)挑选轻、重链基因分别整合在染色体1q1和1q13的单克隆细胞；(8)摇瓶培养单克隆细胞，检测表达产量。本专利技术方法的特点和其优越性可通过以下详细的描述进一步体现。附图说明图1C5抗体轻、重链编码基因双整合在DG44细胞染色体1q1和1q13区图2clone1经纯化后获得的C5单克隆抗体轻、重链鉴定(LaneM:Marker；Lane1,2:P6001M2-2/P6002-1)图3四种Clone细胞表达人C5单克隆抗体产量比较图4clone1细胞连续传代表达人C5单克隆抗体的产量稳定性评价图5抗人C5单抗对补体旁路激活致RRBC溶血的抑制作用图6抗人C5单抗对补体激活致SRBC溶血的抑制作用图7抗人C5单抗对不同种属血清诱导的补体激活的抑制作用。具体实施方式实施例1抗体表达载体的构建和鉴定根据依库株单抗的公开序列，设计合成抗体的轻重链序列，并经(AvrII和PacI)酶切后分别插入经改造的UCOE表达载体，再经大肠杆菌表达筛选重组菌落，提取质粒进行重组质粒的酶切鉴定，基因序列测序分析鉴定，成功获得抗体的轻、重链真核表达载体BP6001M2-2、BP6002-1。实施例2质粒转染和细胞筛选采用QIAGENPlasmidMidiKit提取BP6001M2-2和BP6002-1转染质粒，转染宿主细胞为DG44(CHO细胞系)，按照FreedomTMCHO-STMKit试剂盒说明书将BP6001M2-2和BP6002-1质粒共转染。转入质粒的细胞置于6孔板(37℃、5％CO2)至48h，细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。重组质粒转染48h后，采用10nMMTX进行加压筛选，存活细胞继续培养并逐步增加MTX浓度至500nM；细胞接种于半固体培养基(6孔培养板，密度为500cells/ml)，于37℃孵箱中培养2周。待细胞逐渐长至肉眼可见的集落时，ClonePixFL挑取单集落制备单克隆细胞。共挑取90个荧光MAX＞1000的细胞克隆至96孔板中，继续培养并逐步转移至24孔板和6孔板培养(加压维持500nMMTX)。实施例3染色体和探针制备向培养的单克隆细胞中加入秋水仙素(终浓度为1μg/mL)，37℃箱继续孵育3h，收集细胞，按照常规方法进行染色体制备；分别根据轻、重链质粒信息设计特异引物，采用PCR方法扩增目的基因，并用于探针标记，探针标记及纯化分别按照“RandomPrimedDNALabelingKit”(1104760001，Roche)“PCRPurificationKit”说明书进行操作。实施例4荧光原位杂交(FISH)将制备的染色体进行78℃变性(2×SSC/70％甲酰胺)处理6min，依次置入70％、85％、100％冰乙醇中各5min进行脱水处理，然后置37℃温箱中干燥；探针置78℃水浴中变性10min，立即放冰上冷却5min，37℃放置30min后再滴加至变性处理的染色体玻片上，封片并置于37℃湿盒中杂交反应过夜；杂交完成后去除封片，在2×SSC/50％甲酰胺溶液中(43℃的)放置15min，用2×SSC/0.01％Tween20(43℃)洗片3次，每次2min；用2×SSC溶液洗片，室温2min；滴加100μl的FITC-Streptavidin(1：20稀释)，盖上盖坡片，37℃避光温浴40min；去除盖玻片，用2×SSC/0.01％Tween20洗片，室温2min，洗片3次；2×SSC，2min，洗片1次，依次置于70％、85％、100％冰乙醇中各5min进行脱水处理，置于暗处自然干燥；加入抗褪色液DAPI/AntifadeSolution复染，覆盖玻片(无水乙醇预先处理)。实施例5靶向本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向筛选双整合位点提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法，其特征在于，所述靶向筛选的双整合位点是位于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞1号染色体长臂。

【技术特征摘要】
1.一种靶向筛选双整合位点提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法，其特征在于，所述靶向筛选的双整合位点是位于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞1号染色体长臂。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向筛选的双整合位点是染色体1q1和1q13区。3.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将人C5抗体的轻、重链编码基因(如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)分别插入真核表达载体，制备轻、重链重组表达质粒；(2)将步骤(1)获得的轻、重链重组表达质粒共转染至CHO细胞，经MTX加压和半固体培养筛选，制备单克隆细胞；(3)采用荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：高小平，张晟，代燕平，何刚，程琳，王雯茜，付伟，
申请(专利权)人：成都贝爱特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51