抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗人载脂蛋白A1(ApoA1)鼠源单克隆抗体D11‑10，所述ApoA1单抗D11‑10的重链亚型为IgG2b，轻链亚型为κ，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。相较于现有基于ApoA1多抗而建立的ApoA1检测方法，本发明专利技术基于该ApoA1单抗D11‑10建立的ApoA1检测方法，能够显著提高冠心病(CHD)的检出率，尤其对于HDL‑C在正常范围的CHD患者，检出率有显著提高。因此，本发明专利技术基于ApoA1单抗D11‑10建立的全新的检测方法，能更好体现ApoA1的检测值与心脑血管疾病的相关性，对于心脑血管疾病的诊断、预防和管理具有重要的临床意义。

Anti human ApoA1 monoclonal antibody and preparation method and application thereof

The present invention discloses an anti-human apolipoprotein A1 (ApoA1) mouse-derived monoclonal antibody D11_10. The heavy chain subtype of the anti-apoA1 monoclonal antibody D11_10 is IgG2b, and the light chain subtype is kappa. The amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable region are shown as SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4, respectively. Compared with the existing ApoA1 detection method based on the ApoA1 monoclonal antibody D11_10, the ApoA1 detection method can significantly improve the detection rate of coronary heart disease (CHD), especially for CHD patients with HDL_C in the normal range. Therefore, the novel detection method based on the monoclonal antibody D11_10 of ApoA1 can better reflect the correlation between the detection value of ApoA1 and cardiovascular and cerebrovascular diseases, and has important clinical significance for the diagnosis, prevention and management of cardiovascular and cerebrovascular diseases.

【技术实现步骤摘要】
抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种抗人载脂蛋白A1(ApoA1)鼠源单克隆抗体D11-10及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及利用该单克隆抗体在临床检测人外周血中ApoA1蛋白的含量以预测发生心脑血管疾病的风险及其对该疾病的诊断。
技术介绍
载脂蛋白A1(ApoA1)是高密度脂蛋白(HDL)的主要结构蛋白，其生理作用在于能帮助HDL捕获游离胆固醇。此外，ApoA1还有稳定环前列腺素，促进血管舒张并抑制血小板凝聚，抵抗血管斑块形成等作用。传统上，临床使用HDL-C和ApoA1蛋白的检测来反映体内HDL代谢的水平。血清/血浆中ApoA1和HDL-C水平的降低，提示心脑血管疾病(CHD、脑卒中等)的危险性增加，是心脑血管疾病危险性评价的灵敏指标之一。然而目前有研究显示，在超过13万CHD患者中，逾4成患者的HDL-C水平处于正常范围，所以HDL-C并不能完全有效地反映疾病风险。贝特类、烟酸和胆甾醇酯转运蛋白(CETP)阻滞剂等提升HDL-C水平的药物都不能减少终点事件(全因或CHD引起的死亡率)，且无法降低卒中风险率，进一步提示HDL-C不能真实反应体内HDL的代谢情况。HDL由新生到成熟，再到被肝脏回收降解是一系列复杂的动态过程。通过超速离心和双向电泳的方法可以将体内代谢过程中的HDL分为不同的亚型，临床相关性研究显示HDL的亚型变化较HDL-C更能反应与心脑血管疾病的相关性。因此，监测体内特定的与疾病相关的功能性HDL亚型显得尤为重要。目前实验室采用的HDL亚型分离和鉴定方法操作难度大、技术要求高、实验时间长，难于满足临床快速、高通量的检测要求，不适合临床应用。虽然检测血清中HDL的主要蛋白成分ApoA1，在一定程度能够反映体内HDL的代谢状态。但是，检测方法大多是基于ApoA1多克隆抗体的免疫学法，不能检测到HDL亚型的变化。因此，开发一种全新的、既能满足临床快速和高通量要求，又能检测与心脑血管疾病相关的HDL亚型的方法，对于心脑血管疾病的预防和管理具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术制备了一种ApoA1单克隆抗体D11-10，所述ApoA1单克隆抗体D11-10的重链亚型为IgG2b，轻链亚型为κ，由BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10所分泌，所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年3月9日，保藏编号CGMCCNo.13807。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术提供了一种ApoA1单克隆抗体D11-10，所述ApoA1单克隆抗体D11-10能够识别ApoA1蛋白特异抗原表位，并能据此甄别与心脑血管疾病相关的HDL特定亚型(D11-10亚型)。本专利技术中，所述ApoA1单克隆抗体D11-10的重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；编码所述重链可变区、轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述ApoA1单抗D11-10能与重组的人ApoA1发生特异性的反应，所述ApoA1单抗D11-10与重组的人ApoA1结合力为1.73×10-10M，其不与相同表达系统中得到的重组蛋白血清淀粉样蛋白A1(SAA1)和β2微球蛋白(β2M)发生反应，也不与市售天然的牛血清白蛋白(BSA)发生反应。本专利技术中，所述ApoA1单抗D11-10的制备过程包括：利用杂交瘤细胞系在小鼠腹腔制备含D11-10单抗的腹水，经ProteinA/G柱亲和层析纯化获得单抗。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体的亚型和亲和力。本专利技术中，所述ApoA1单抗D11-10能够甄别特定构象HDL颗粒中的ApoA1，所述能被该单抗甄别的特定HDL构象被称为HDLD11-10亚型。本专利技术发现了HDLD11-10亚型与CHD的高度相关性，提出了ApoA1单抗D11-10在制备用于诊断心脑血管疾病的产品中的应用。其中，所述心脑血管疾病体外诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。本专利技术还提供了一种心脑血管疾病的诊断产品，包括如上所述的ApoA1单抗D11-10；其中，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体等免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。本专利技术还提供了一种预测待测对象发生心脑血管疾病的风险的方法，通过所述心脑血管疾病的诊断产品测定待测对象的ApoA1蛋白含量，对待测对象发生心脑血管疾病的风险进行预测，当待测对象的ApoA1蛋白含量低于正常人群的参考值时，预测发生心脑血管疾病的风险较高。本专利技术还提供了一种诊断心脑血管疾病的方法，通过所述心脑血管疾病的诊断产品测定待测对象的ApoA1蛋白的含量，对心脑血管疾病进行诊断。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包括如上所述的ApoA1单抗D11-10。本专利技术还提供了所述心脑血管疾病的诊断产品的应用，所述心脑血管疾病的诊断产品可通过ApoA1单抗D11-10识别、定量特定的ApoA1抗原表位，来反映外周血中HDLD11-10亚型的水平，以监测心脑血管疾病风险及用于心脑血管疾病的诊断。本专利技术中，所述心脑血管疾病的诊断产品可以用于全血、血清或血浆中以及组织提取物中的ApoA1的检测。本专利技术中，所述心脑血管疾病主要包括由血管斑块形成导致的疾病。本专利技术中，所述心脑血管疾病为CHD、脑卒中或动脉粥样硬化。本专利技术的有益效果在于，本专利技术所述ApoA1单抗D11-10能够通过识别特定ApoA1抗原表位来甄别HDLD11-10亚型，该单抗与重组人ApoA1蛋白的结合力为1.73×10-10M，具有较高的亲和力和特异性；并且在本专利技术所测定的蛋白中，该单抗只与重组的以及血中天然的ApoA1发生特异性反应，不与如SAA1、β2M和BSA等无关蛋白反应。所述ApoA1单抗D11-10对群体不同样本的测试结果呈离散型分布，提示其能够反映样本间的HDL异质性，即能够通过对ApoA1的检测，来反映样本中HDLD11-10亚型的水平。相较于现有HDL-C检测技术和ApoA1免疫比浊试剂盒(以ApoA1多抗为基础)的检测结果，本专利技术HDLD11-10亚型与CHD疾病更具相关性，能够更显著区分CHD和对照组，尤其提高了HDL-C在正常参考范围内的经冠状动脉造影术确诊(临床诊断金标准)的CHD病患的一致率。因此，利用ApoA1单抗D11-10发展的检测方法可以改善现有技术的灵敏度，提高对心脑血管疾病的检出率。采用本专利技术的ApoA1单抗D11-10，发展适用于临床高通量免疫比浊自动化检测的试剂盒，可实现对心脑血管疾病的风险预测和临床监测，同时又进一步地为阐明疾病的发生发展机制打下了基础。附图说明图1为ApoA1单抗D11-10的结合力检测。用重组人ApoA1蛋白包被板，系列稀释ApoA1单抗D11-10，采用直接ELISA方法检测，ApoA1单抗D11-10与重组人ApoA1蛋白的结合力为1.73×10-10M。图2为ApoA1单抗D11-10的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，及编码其重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。图3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ApoA1单克隆抗体D11‑10，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11‑10能够特异性识别ApoA1蛋白特定抗原表位。

【技术特征摘要】
2017.04.01 CN 20171021292751.一种ApoA1单克隆抗体D11-10，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-10能够特异性识别ApoA1蛋白特定抗原表位。2.如权利要求1所述的ApoA1单克隆抗体D11-10，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-10由BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10分泌，所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株D11-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年3月9日，保藏编号为CGMCCNo.13807。3.如权利要求1所述的ApoA1单克隆抗体D11-10，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-10的重链亚型为IgG2b，轻链亚型为κ，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；编码所述重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。4.如权利要求1～3之任一项所述的ApoA1单克隆抗体D11-10在制备用于诊断心脑血管疾病产品中的应用。5.一种心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，包括如权利要求1～3之任一项所述的ApoA1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，张艳，王荣芳，钱震斌，
申请(专利权)人：德赛诊断系统上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31