前列腺癌干细胞标志物、抗体OV6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法技术

本发明专利技术涉及医药技术研究领域，提出了前列腺癌干细胞标志物、抗体OV6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法。本发明专利技术的标记方法用小鼠源性OV6抗体标记前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞；然后与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育；接着置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性前列腺癌细胞；最后，采用流式细胞术检测OV6阳性前列腺癌细胞标记效率。进一步地，在用小鼠源性OV6抗体标记前，用恩杂鲁胺进行药物刺激，以增强标记效果。本发明专利技术能够对前列腺癌干细胞进行显著标记，OV6阳性细胞具有高表达干性相关基因，高成球率和高成瘤率。本发明专利技术的标记方法具有较高的特异性和敏感性，具有重要的临床价值。

【技术实现步骤摘要】
前列腺癌干细胞标志物、抗体OV6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法
本专利技术涉及医药技术研究领域，特别涉及前列腺癌干细胞标志物、抗体OV6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法。
技术介绍
前列腺癌(ProstateCancer,PCa)是仅次于肺癌的发病率最高的肿瘤之一，特别在发达国家的男性中，前列腺癌已成为发病率最高的肿瘤。据2015年公布的全球数据估计，每年新发前列腺癌患者达111.2万人，30.8万人死于前列腺癌。相对西方国家，亚洲地区前列腺癌的发病率和病死率较低，在中国，前列腺癌的发病率及病死率远低于世界平均水平。然而，研究数据表明，中国的前列腺癌发病率正在逐年攀升，前列腺癌的发病率在近30年间增长了将近6倍，死亡人数则从每年约6000人上升到每年近1.8万人，增长幅度超过了200％，并且新发晚期前列腺癌的比例接近30％，远远高于世界平均水平。另一项2015年的研究调查显示，中国每年前列腺癌新发病例超过6万人，新增死亡病例估计在2.66万人。因此，前列腺癌不仅是世界范围内重要的健康问题，在我国，因其发病率和死亡率增长之迅速，以及晚期前列腺癌的高发比例，前列腺癌亦成为威胁国民健康的重要问题之一。肿瘤干细胞被认为是癌症复发、转移的主要原因，癌症治疗中以肿瘤干细胞为靶标的重要性已被指出。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞比率较低，特异性识别肿瘤干细胞并进行治疗是极其困难的。肿瘤干细胞的检测技术以及以肿瘤干细胞为靶标的新疗法的开发已成为癌症医疗中的重要课题。目前，作为已知的肿瘤干细胞标记，有CD133、CD24、CD44等分子标记，据说仅在极少数癌细胞中具有有效性，为了在更多种类的癌症中检测肿瘤干细胞，需要鉴定新的分子标记。目前前列腺癌干细胞的标志物主要包括CD133、CD44、整合素α2β1等，但是，一方面，他们表征的前列腺癌细胞是否属于前列腺癌干细胞还存在争议，有研究报道，隐藏在CD44+α2β1hi下的CD133-细胞才是肿瘤起始细胞，另一方面，这些标志物在多数前列腺癌细胞系和组织中的表达丰度存在较大差异，这些都大大影响了前列腺癌干细胞研究的深入和临床应用的探索。
技术实现思路
本专利技术一方面提供了一种前列腺癌干细胞标志物，标志物为抗体OV6。本专利技术另一方面提供了抗体OV6在前列腺癌干细胞标志材料中的应用。本专利技术还提供了一种利用OV6作为标志物对前列腺癌干细胞进行标记的方法，包括以下步骤：a.利用MiniMACSTMCellSorter(MiltenyiBiotec，BergischGladbach，Germany)进行磁激活细胞分选(MACS)，具体为用小鼠源性OV6抗体标记前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞30分钟；b.将OV6抗体标记的前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞，与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育；c.将孵育后的体系置于MACSMS柱(MiltenyiBiotec，BergischGladbach，德国)上进行过滤分离，得到OV6阳性前列腺癌细胞，即为前列腺癌干细胞。MiniMACSTMCellSorter为细胞分选仪，磁激活细胞分选(MACS)为利用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞，在外加磁场的作用下，将样品中与不带磁的细胞分开，达到分离纯化目的的方法。MACS为现有技术手段。具体地，前列腺癌细胞系为C4-2和C4-2B。前列腺癌细胞系C4-2和C4-2B是由LelandChung博士认证(雪松-西奈医学中心，洛杉矶，CA，美国)提供的。C4-2、C4-2B细胞在RPMI1640培养液(11835093，Gibco，美国)含10％胎牛血清(FBS，10099-141、Gibco、美国)中培养，辅以1％青霉素/链霉素(15140122，Gibco，美国)。优选地，前列腺癌细胞系C4-2、C4-2B细胞在RPMI1640培养液含10％胎牛血清中培养，辅以1％青霉素/链霉素。进一步地，步骤a中的前列腺癌细胞系在用小鼠源性OV6抗体标记前，采用恩杂鲁胺(Enzalutamide，ENZ，S1250，Selleck，USA)对其进行药物刺激。由于前列腺癌细胞所具有的抗药性，直接用小鼠源性OV6抗体进行标记时，标记效果虽然优于现有的前列腺癌干细胞标志物，但标记效果的显著性仍需要提高，本专利技术在前列腺癌细胞系与抗体结合前，先用恩杂鲁胺对前列腺癌细胞系进行刺激，处理掉抗药性较低的前列腺癌细胞，保留恶性程度更高的前列腺癌细胞，如此，OV6对前列腺癌细胞的标记效果大大增强。恩杂鲁胺为前列腺癌内分泌治疗失败的二线用药，是目前治疗晚期激素抵抗性前列腺癌的重要药物。但是绝大多数患者接受恩杂鲁胺一段时间后都会表现出药物抵抗，进而出现疾病进展，在本申请中，采用恩杂鲁胺预先处理掉抗药性低的前列腺癌细胞，进而能够筛选出高恶性的前列腺癌细胞。在一个具体实施例中，分别将5×106个前列腺癌细胞系，例如C4-2和C4-2B细胞铺板于10cm皿中，24小时后加入恩杂鲁胺，刺激48小时。恩杂鲁胺(Enzalutamide，ENZ，S1250，Selleck，USA)。铺板5×106个细胞，24小时贴壁细胞密度为60-70％，加入恩杂鲁胺刺激48小时，恩杂鲁胺药物通过阻断雄激素受体发挥药物作用，刺激48小时，敏感细胞会出现显著凋亡。为了检验OV6对前列腺癌干细胞的标记效率，步骤c后还包括采用流式细胞术检测OV6阳性前列腺癌细胞标记效率的步骤，具体如下：d.对于上述步骤中OV6阳性前列腺癌细胞进行OV6表达比例检测，利用APC偶联的OV6抗体(1:50，FAB2020A，R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)标记OV6阳性前列腺癌细胞；e.利用CyanADP分选仪(Beckman，CA，USA)进行流式细胞术测定APC-OV6(APC偶联的OV6抗体)细胞的比例分布，即得到OV6阳性前列腺癌细胞的标记效率。流式细胞术(FlowCytoMetry，FCM)是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术能够对前列腺癌干细胞进行显著标记，OV6基础表达丰度稳定在2-8％之间，并且OV6阳性细胞具有干性相关表型，即高表达干性相关基因，高成球率和高成瘤率。(2)本专利技术前列腺癌细胞系在用小鼠源性OV6抗体标记前，先采用恩杂鲁胺进行药物刺激，保留高恶性前列腺癌细胞，增强了OV6对前列腺癌细胞的标记效果。(3)本专利技术的标记方法具有较高的特异性和敏感性，具有重要的临床价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：通过磁激活细胞分选(MACS)标记OV6阳性前列腺癌细胞的过程；图2：通过流式细胞术计算的APC-OV6的百分比；图3：正常前列腺和前列腺癌组织中，代表性苏木精伊红(H&E)染色和OV6的免疫组织化学(IHC)染色；图4：正常前列腺和前列腺癌组织中OV6的IHC评分；图5：前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种前列腺癌干细胞标志物，其特征在于，标志物为抗体OV6。

【技术特征摘要】
1.一种前列腺癌干细胞标志物，其特征在于，标志物为抗体OV6。2.抗体OV6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用。3.一种利用OV6作为标志物对前列腺癌干细胞进行标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.用小鼠源性OV6抗体标记前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞30分钟；b.将磁性标记的前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞，与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育；c.将孵育后的体系置于MACSMS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性前列腺癌细胞，即为前列腺癌干细胞。4.根据权利要求3所述的利用OV6作为标志物对前列腺癌干细胞进行标记的方法，其特征在于，所述前列腺癌细胞系为C4-2和C4-2B。5.根据权利要求4所述的利用OV6作为标志物对前列腺癌干细胞进行标记的方法，其特征在于，所述前列腺癌细胞系C4-2、C4-2B细胞在RPMI1640培...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙颖浩，王超，鲁欣，高旭，黄海，孔德沛，李惠珍，瞿旻，
申请(专利权)人：上海长海医院，
类型：发明
国别省市：上海,31