重组PICP蛋白和用于制备与其特异性结合的抗体的方法技术

本发明专利技术涉及重组PICP蛋白和制备与其特异性结合的抗体的方法，并且更具体地涉及：一种与PICP特异性结合的抗体或其片段；一种酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒和用于诊断代谢性骨病的组合物，两者都含有所述抗体或其片段；一种使用所述抗体或其片段检测PICP的方法；一种编码所述抗体或片段的多核苷酸，以及一种包含所述多核苷酸的重组表达载体；一种所述重组表达载体转化的细胞；和一种通过使用所述重组表达载体制备与PICP特异性结合的抗体或其片段的方法，以及一种制备重组PICP蛋白的方法。通过使用本发明专利技术所述方法，可以容易地以高纯度和高产率制备PICP，其为蛋白质复合物。此外，根据本发明专利技术，所述抗体或其片段对PICP具有非常高的结合亲和力和结合特异性，并且与类似的多肽无交叉反应性，并且指定了对抗原结合重要的氨基酸序列，因此抗体可以容易地和重复大量生产。根据本发明专利技术，所述抗体和方法可用于开发用于检测PICP的试剂盒或使用PICP的诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组PICP蛋白和用于制备与其特异性结合的抗体的方法
本专利技术涉及一种重组PICP蛋白质和一种用于生产与其特异性结合的抗体的方法，并且更具体地，涉及一种与PICP特异性结合的抗体或其片段、一种包括所述抗体或其片段的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、一种含有所述抗体或其片段的用于诊断代谢性骨病的组合物、一种使用所述抗体或其片段检测PICP的方法、一种编码所述抗体或其片段的多核苷酸、一种包括所述多核苷酸的重组表达载体、一种所述重组表达载体转染的细胞、一种通过使用所述重组表达载体生产与PICP特异性结合的抗体或其片段的方法以及一种生产重组PICP蛋白的方法。
技术介绍
本申请要求2015年12月30日提交的韩国专利申请号10-2015-0189684的优先权和权益，其全部内容通过引用结合于此。胶原蛋白(collagen)是动物结缔组织中细胞外基质的主要结构蛋白。胶原蛋白是哺乳动物中表达最多的蛋白质之一，并且据估计占所有表达的蛋白质的约25-35％。胶原蛋白是一种纤维形式的蛋白质，并且主要存在于纤维组织如腱、韧带和皮肤中。在这些中，I型胶原蛋白(gollagentypeI)是人体中最常表达的胶原蛋白，其构成胶原纤维，在腱、韧带、肌肉纤维、骨骼、真皮、牙齿的牙本质等中表达，并且也存在于创伤再生过程中留下的瘢痕组织中。I型胶原蛋白具有带有异源三聚体的三螺旋结构，其中胶原α1链(或α-1型胶原蛋白)多肽和胶原α2链多肽以2:1的比例缠绕在一起。I型胶原蛋白的分子量为约285kDa。与其他胶原蛋白一样，1型胶原蛋白由称为前胶原的前体产生。除了具有三螺旋结构的胶原蛋白外，前胶原还含有在N端和C端被特定蛋白酶切割的前肽。在细胞中合成的α1和α2多肽从在内质网中从C端前肽开始形成三螺旋纤维结构。完成三螺旋结构的前胶原从细胞中分泌出来，并且N端和C端的前肽被细胞外基质中的金属蛋白酶除去，使得前胶原成熟为胶原蛋白。成熟的胶原蛋白相互交联，最终形成胶原纤维。在前胶原成熟为胶原蛋白期间，当N端和C端前肽未被正常切割时，胶原蛋白的三螺旋结构异常，导致胶原蛋白功能缺陷。此外，1型胶原纤维在特别是构成和支撑骨骼中起着重要作用，并且因此α1或α2链中的突变导致成骨不全症，如脆骨病。1型前胶原，C端前肽(PICP)对于由1型前胶原形成三螺旋结构是必需的，并且由于其是从胶原蛋白成熟程序中分离出来的，因此其为测量胶原蛋白代谢的重要指标。1型前胶原是由成骨细胞、成软骨细胞等产生和分泌的。PICP可以用作骨生长以及骨和关节疾病如骨质疏松症和关节炎的标志物(marker)。因此，需要开发能够以高灵敏度检测PICP的技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术人首先制备了一种作为蛋白质复合物的重组PICP蛋白，并通过筛选scFv噬菌体文库和酵母Fab文库来选择对重组PICP蛋白特异的抗体片段的片段并将该抗体片段转换成通常使用的IgG形式开发了一种新抗体，并因此，本专利技术人完成了本专利技术。因此，本专利技术的一个方面是提供一种与I型前胶原C端前肽(PICP)特异性结合的抗体或其片段，跟抗体或其片段包含：重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VH)，重链可变结构域包含重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，重链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:13、SEQIDNO:25和SEQIDNO:37组成的组的氨基酸序列，重链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:15、SEQIDNO:27和SEQIDNO:39组成的组的氨基酸序列，重链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:17、SEQIDNO:29和SEQIDNO:41组成的组的氨基酸序列，轻链可变结构域包含轻链互补决定区1(CDR1)、轻链互补决定区2(CDR2)和轻链互补决定区3(CDR3)，轻链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:19、SEQIDNO:31和SEQIDNO:43组成的组的氨基酸序列，轻链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:21、SEQIDNO:33和SEQIDNO:45组成的组的氨基酸序列，轻链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQIDNO:11、SEQIDNO:23、SEQIDNO:35和SEQIDNO:47组成的组的氨基酸序列。本专利技术的另一方面是提供一种酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，其包含本专利技术所述的抗体或其片段。本专利技术的又一方面是提供一种用于诊断代谢性骨病的组合物，组合物包含本专利技术的抗体或其片段。此外，本专利技术的一个方面是提供一种用于诊断代谢性骨病的组合物，组合物由本专利技术的抗体或其片段组成。此外，本专利技术的一个方面是提供一种用于诊断代谢性骨病的组合物，组合物基本上由本专利技术的抗体或其片段组成。本专利技术的又一方面是提供一种本专利技术的抗体或其片段在制备用于诊断代谢性骨病的试剂中的用途。本专利技术的又一方面是提供一种用于诊断受试者中代谢性骨病的方法，方法包括：(a)从受试者获取生物样品；(b)使用本专利技术的抗体或片段测定生物样品中PICP蛋白的水平；和(c)将所测定的PICP蛋白水平与正常受试者中PICP蛋白的水平进行比较。本专利技术的又一方面是提供一种PICP特异性检测方法，其包含：(1)准备样品；(2)使本专利技术的抗体或片段与样品接触；和(3)检测抗体或其片段。本专利技术的又一方面是提供一种编码本专利技术的抗体或其片段的多核苷酸。本专利技术的又一方面是提供一种包含多核苷酸的重组表达载体。本专利技术的又一方面是提供一种用重组表达载体转染的细胞。本专利技术的又一方面是提供一种制备与PICP特异性结合的抗体或其片段的方法，方法包括：(a)用重组表达载体转染宿主细胞；(b)培养经转染的宿主细胞以制备抗体或其片段；和(c)收获在宿主细胞中制备的抗体或其片段。本专利技术的又一方面是提供一种制备重组PICP蛋白的方法，方法包括：(i)构建分别包含编码PICPα1链和PICPα2链的多核苷酸的重组表达载体，刺激细胞外分泌的信号肽和标记蛋白与PICPα1链和PICPα2链结合(缀合，conjugate)；(ii)用包含编码PICPα1链的多核苷酸的重组表达载体和包含编码PICPα2链的多核苷酸的重组表达载体的混合物共转染细胞；(iii)培养经共转染的细胞；和(iv)获得细胞中产生的PICP蛋白。技术方案根据本专利技术的一个方面，提供了一种与I型前胶原C端前肽(PICP)特异性结合的抗体或其片段，抗体或其片段包含：重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VH)，重链可变结构域包含重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，重链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:13、SEQIDNO:25和SEQIDNO:37组成的组的氨基酸序列，重链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:15、SEQIDNO:27和SEQIDNO:39组成的组的氨基酸序列，重链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:17、SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与I型前胶原C端前肽(PICP)特异性结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含：重链可变结构域(VH)，包含重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，所述重链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:37组成的组的氨基酸序列，所述重链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:39组成的组的氨基酸序列，所述重链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列，和轻链可变结构域(VH)，包含轻链互补决定区1(CDR1)、轻链互补决定区2(CDR2)和轻链互补决定区3(CDR3)，所述轻链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:43组成的组的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:45组成的组的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:47组成的组的氨基酸序列。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.30 KR 10-2015-01896841.一种与I型前胶原C端前肽(PICP)特异性结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含：重链可变结构域(VH)，包含重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，所述重链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:13、SEQIDNO:25和SEQIDNO:37组成的组的氨基酸序列，所述重链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:15、SEQIDNO:27和SEQIDNO:39组成的组的氨基酸序列，所述重链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:17、SEQIDNO:29和SEQIDNO:41组成的组的氨基酸序列，和轻链可变结构域(VH)，包含轻链互补决定区1(CDR1)、轻链互补决定区2(CDR2)和轻链互补决定区3(CDR3)，所述轻链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:19、SEQIDNO:31和SEQIDNO:43组成的组的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:21、SEQIDNO:33和SEQIDNO:45组成的组的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQIDNO:11、SEQIDNO:23、SEQIDNO:35和SEQIDNO:47组成的组的氨基酸序列。2.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含选自以下各项组成的组的重链可变结构域和轻链可变结构域：重链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重链互补决定区1、含有由SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重链互补决定区2和含有由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的重链互补决定区3；和轻链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:7所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、含有由SEQIDNO:9所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和含有由SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3；重链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:13所示氨基酸序列的重链互补决定区1、含有由SEQIDNO:15所示氨基酸序列的重链互补决定区2和含有由SEQIDNO:17所示的氨基酸序列的重链互补决定区3；和轻链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:19所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、含有由SEQIDNO:21所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和含有由SEQIDNO:23所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3；重链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:25所示氨基酸序列的重链互补决定区1、含有由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的重链互补决定区2和含有由SEQIDNO:29所示的氨基酸序列的重链互补决定区3；和轻链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:31所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、含有由SEQIDNO:33所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和含有由SEQIDNO:35所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3；和重链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:37所示氨基酸序列的重链互补决定区1、含有由SEQIDNO:39所示氨基酸序列的重链互补决定区2和含有由SEQIDNO:41所示的氨基酸序列的重链互补决定区3；和轻链可变结构域，包含含有由SEQIDNO:43所示氨基酸序列的轻链互补决定区1、含有由SEQIDNO:45所示氨基酸序列的轻链互补决定区2和含有由SEQIDNO:47所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3。3.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述重链可变结构域包含选自由SEQIDNO:49、SEQIDNO:53、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：金圣勋，徐佑荣，姜遂瞋，金容星，金廷湖，白头山，
申请(专利权)人：医药生命融合硏究团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR