用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术制造技术

本发明专利技术提供，并且在某些具体但非限制性的方面中涉及：方法，所述方法用于修饰和/或改进ISV’s从而消除或减少其产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向；‑可以引入ISV的修饰，其消除或减少所述ISV产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向；‑被特异性选择(例如，使用本文所述的测定法)从而不具有或具有较低/减小的产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向的ISV’s；‑被修饰和/或改进的ISV’s，其不具有或具有较低/减小的产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向。

Techniques for predicting, detecting, and reducing nonspecific protein interference in assays involving single variable domains of immunoglobulins

The present invention provides, and in some specific but non-limiting aspects relates to: methods for modifying and/or improving ISV's to eliminate or reduce its tendency to produce the protein interference or the signal; modifications may be introduced to eliminate or reduce the protein interference or the signal generated by the ISV. 8206 .

【技术实现步骤摘要】
用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术本申请是申请日为2012年6月25日、专利技术名称为“用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术”的中国专利申请No.201280030902.9的分案申请。
本专利技术涉及免疫球蛋白单可变结构域领域。
技术介绍
免疫球蛋白单可变结构域或“ISV”在本文中通常定义为这样的氨基酸序列，其-包含免疫球蛋白折叠或在适合的条件下(如生理条件下)能够形成免疫球蛋白折叠(即通过折叠)，即从而形成免疫球蛋白可变结构域(如，例如，VH，VL或VHH结构域)；和-形成(或在这样适合的条件下能够形成)免疫球蛋白可变结构域，其包含功能性抗原结合位点(在其不需要与另一个免疫球蛋白可变结构域相互作用(如VH-VL相互作用)以形成功能性抗原结合位点的意义上)。本领域目前已知的免疫球蛋白单可变结构域的一些实例是VHH’s和/或(其它)纳米抗体,dAb’s和(单)结构域抗体。在这些之中，到提交本申请之日时，各种纳米抗体处于I期和II期临床试验中。这使得获得可靠的测定法变得重要，所述测定法用于分析来自用ISV’s治疗的人(如临床试验受试者，和在所述ISV’s上市后，用所述ISV’s治疗的患者)的生物样品。这不仅对于管理目的是重要的，而且对于用生物药物治疗患者也是重要的，因为开出所述治疗处方的临床医生也希望获得监测治疗的各个方面的可靠测定法。例如，在生物药物分子的临床开发中，重要的是评估它们的免疫原潜力，以及具体地它们可以激发所谓“抗-药物抗体”或“ADA’s”的程度。这可以使用所谓的“抗-药物抗体”或“ADA’s”(免疫测定法)进行测定(见例如Shankar等的综述，JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis(药物和生物医学分析杂志),48(2008),1267-1281；以及Mire-Sluis等,J.Immunol.Meth.289(2004),1-16；Peng等,JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis(药物和生物医学分析杂志),54,(2011),629-635；和Loyet等,J.Immunol.Meth.345(2009),17-28。所述ADA测定法和进行该测定法的方法是药学领域的标准常识并且在生物药物产品的临床开发中常规使用它们(并且也为世界上的各个管理机构所要求)。例如，如在Mire-Sluis的文章第3和第4页上所述，并且如例如也在Peng的文章的图中示意性地举例，已知许多不同的ADA测定法形式，如“ELISA-桥接形式”，“ELISA-直接形式”，“间接形式”，放射免疫沉淀测定法(RIP),“表面等离振子共振”和“电化学发光-桥接形式”。本领域技术人员清楚进行ADA免疫测定法的其它形式。技术人员也熟悉许多不同的商购技术平台，其已经显示适合于建立和进行ADA测定法。这些包括但不限于MSD平台(Mesoscale)，Gyrolab(Gyros)和octet平台(Fortebio)。ADA测定形式的一些非限制性实例也在图1A-1C中示意性地显示。通常，应该注意在这些用于检测或测量针对ISV的ADA’s的ADA测定法中，ISV用作“分析试剂”(即，作为用于检测任何ADA’s在测试样品中是否存在的化合物)”，并且ADA’s是“抗原”(即，在测试的样品中待检测的化合物)。因此，在这些测定法中，ISV通常/经常结合于载体(如ELISA板)，而ADA’s(如果存在)在进行测定法的样品中存在。为了更好地理解本文所述的本专利技术，也应该注意-作为对比-在本文中用于预测ISV是否产生蛋白干扰的方法中，ISV通常用作“抗原”(即，作为待检测的化合物)，并且抗体(其如本文进一步所述)用作“分析试剂”(即作为分别检测给定的ISV是否结合；并且由此分别检测其是否具有产生蛋白干扰的较高或增加的风险的工具)。因此，在根据本专利技术的这种方法中，用作分析试剂的抗体(其在本文中也称为“分析抗体”)通常结合于载体(即结合于ELISA板)，并且ISV(存在)于待测试的样品中。然而，通常应该注意到本专利技术不限于其中“分析抗体”结合于载体的测定法。例如，在进行根据本专利技术的测定法的备选方法中(如例如在图1中显示并且在实施例中描述)，分析抗体替代性地用作桥接剂(bridgingagent)，并且因此在溶液中而不是结合于板(尽管其通过包被在板上的ISV间接结合于板)。然而，也在实施例中所述的特异性桥接测定法中(其是竞争性测定法)，分析抗体仍旧用作分析试剂(即，分别确定目的ISV是否结合；并且因此分别确定其是否具有产生蛋白干扰的较高风险或增加的风险)。还设想，基于本文进一步的公开内容，技术人员能够设计其他的测定形式，其中分析抗体可以用作分析试剂从而分别确定给定的ISV是否能够结合；并由此确定其是否具有产生蛋白干扰的较高或增加的风险)。作为研究单链Fv's或"ScFv's"(其是包含免疫球蛋白单可变结构域的构建体，并且类似于ISV's，不与恒定结构域缔合)的结果，已经在本领域中描述，免疫球蛋白可变结构域的C端形成疏水补片(hydrophobicpatch)，其在抗体中被埋在可变结构域和恒定结构域之间的界面中，但是当可变结构域不与恒定结构域缔合时，成为溶剂-暴露的(Nieba等,ProteinEngineering,10,435-444(1997))。还描述了暴露的C-端可以形成B-细胞表位，其可以产生抗-药物抗体和/或与(新出现和/或预先存在的)抗-药物抗体相互作用(WO11/07586)，可以接着使用上述提及的ADA测定法来确定它的存在。为此原因，已经提议对形成可变结构域的C-端的部分的一些氨基酸残基进行突变以减少所述疏水性和/或去除所述表位。例如，Nieba等提议突变VH区的位置11,14,41,84,87和/或89(按照Kabat编号)，而在WO11/07586中，提议突变VL结构域的位置99,101和/或148(AHo编号)或VH结构域的位置12,97,98,99,103和/或144(也是AHo编号–这些位置对应于根据Kabat的位置11,83,84,85,89和103)。然而，这些参考文献中都没有意识到在受试者的血液或血清中存在的某些蛋白会干扰涉及ISV's的ADA测定法，并且因为此，这些文献中并不涉及(也没有提供方案给)这样的问题，即在所述ADA测定法中怎样避免非特异性蛋白干扰，从而允许ADA测定法用于确定待测试样品中(新出现或已经存在的)抗-药物抗体的真实存在/程度。
技术实现思路
作为对比，本专利技术提供这样的方法和测定法，其容易使技术人员预测免疫球蛋白单可变结构域是否具有在ADA测定法中遭受非特异性蛋白干扰的倾向。本文所述的方法和测定法还允许技术人员，在发现可变结构域可能具有在ADA测定法中遭受所述蛋白干扰的倾向或风险时，容易测试可变结构域(提议)的修饰从而预测任何这样(提议)的修饰是否减少或基本上完全避免这样的蛋白干扰。本专利技术还描述了可以对可变结构域进行许多修饰从而减少或基本避免这样的蛋白干扰。根据一个非限制性的方面，这种修饰包括将有限量(如本文进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于ISV的生物制品，其包含一种或多种ISV并且另外包含一种或多种其它的治疗结构部分和/或一种或多种影响所述基于ISV的生物制品的药物代谢动力学或药效学性质的其它结构部分，其中所述基于ISV的生物制品在其C‑端末端具有ISV，该ISV在其C‑端具有序列VTVSS(X)n，其中n＝1至10并且X表示独立地选自天然存在的氨基酸的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
2011.09.30 EP PCT/EP2011/067132;2012.06.14 EP PCT/1.基于ISV的生物制品，其包含一种或多种ISV并且另外包含一种或多种其它的治疗结构部分和/或一种或多种影响所述基于ISV的生物制品的药物代谢动力学或药效学性质的其它结构部分，其中所述基于ISV的生物制品在其C-端末端具有ISV，该ISV在其C-端具有序列VTVSS(X)n，其中n＝1至10并且X表示独立地选自天然存在的氨基酸的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的基于ISV的生物制品，其中所述一种或多种其它结构部分影响所述基于ISV的生物制品的半衰期。3.根据权利要求1或权利要求2所述的基于ISV的生物制品，其中所述一种或多种其它结构部分增加所述基于ISV的生物制品的半衰期。4.根据前述权利要求中任一项所述的基于ISV的生物制品，其中n＝1、2、3、4或5。5.根据前述权利要求中任一项所述的基于ISV的生物制品，其中每个X独立地选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。6.根据前述权利要求中任一项所述的基于ISV的生物制品，其中a)n＝1、2或3，其中每个X＝Ala或Gly；或b)n＝1、2或3，其中每个X＝Ala；或c)n＝1、2或3，其中每个X＝Gly；或d)n＝2或3，其中至少一个X＝Ala或Gly；或e)n＝2或3，其中除了一个X之外所有的X＝Ala或Gly。7.根据前述权利要求中任一项所述的基于ISV的生物制品，其中a)X是Ala，并且n是1、2或3；或b)X是Gly，并且n是2或3。8.根据前述权利要求中任一项所述的基于ISV的生物制品，其中X是Ala并且n是1。9.根据前述权利要求中任一项所述的基于ISV的生物制品，其中所述ISV已经通过在C-端区引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失进行修饰，所述C-端区包含C-端序列VTVSS(SEQIDNO:33)和位置11、13、14、15、82、82a、82b、83、84、107和108处的氨基酸残基。10.根据权利要求9所述的基于I...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤迪特·鲍迈斯特，玛丽葆拉·吕西安娜·阿曼达·布什，卡罗·布东，玛丽安格·比斯，维尔勒·斯诺尔克，斯特凡妮·斯塔埃朗，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE