检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡及其制备方法和应用，属于添加剂检测技术领域。该检测卡上设有顺次搭接粘贴在背衬上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有第一质控线、检测线和第二质控线；金标垫上包被有胶体金标记的第一抗体，第一抗体为特异性抗酚类抗氧化剂的抗体；检测线包被有完全抗原，所述完全抗原为酚类抗氧化剂与载体蛋白的偶联物；第一质控线和第二质控线均包被有第二抗体，第二抗体可与所述第一抗体特异性结合，且不与所述完全抗原结合。上述检测卡能够同时检测多种酚类抗氧化剂，采用双质控线，结果准确，结构简单，使用方便，适用于酚类抗氧化剂的快速检测。

Immunochromatographic assay card for detecting phenolic antioxidants and its preparation and Application

The invention relates to an immunochromatographic detection card for detecting phenolic antioxidants, a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of additive detection. A sample pad, a gold label pad, a cellulose nitrate membrane and a water absorbing pad are arranged on the card, which are successively overlapped on the backing; a first quality control line, a detection line and a second quality control line are successively arranged on the cellulose nitrate membrane from the sample pad end to the water absorbing pad end; a first antibody is coated with a colloidal gold label on the gold label pad, and the first antibody is special. The detection line is coated with a complete antigen, the complete antigen is a conjugate of phenolic antioxidants and carrier proteins, the first and second quality control lines are coated with a second antibody, and the second antibody can specifically bind to the first antibody, and does not bind to the complete antigen. The card can simultaneously detect many phenolic antioxidants, and adopts double quality control line. The result is accurate, the structure is simple, and the use is convenient. It is suitable for the rapid detection of phenolic antioxidants.

【技术实现步骤摘要】
检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡及其制备方法和应用
本专利技术涉及添加剂检测
，特别是涉及一种检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡及其制备方法和应用。
技术介绍
食品安全问题是关系民生的重大问题之一，受到了社会和消费者极大的重视，而食品安全不仅指食品自身的安全，还包括食品包装材料使用安全等。目前食品包装主要以塑料包装为主，而为了提高塑料产品的力学性能、化学稳定性及使用寿命等应用性能，往往会在材料基体中添加一些抗氧化剂、光稳定剂、热稳定剂、增塑剂等小分子物质。这些小分子添加剂会由于其与塑料基体材料相容性的差异，从而由材料内部向材料表面迁移。而食品包装往往是直接与食物直接接触，这就造成了食物在储存和运送过程中，塑料包装中的添加剂会由包装材料中迁移到食品中，进而导致食品中的有害化学物质超标，威胁到消费者的身体健康。塑料中加入抗氧化剂，可降低塑料在加工过程中受热氧化，减缓塑料在储存使用过程中由于曝露在光线下而进行的自发氧化，防止塑料变黄、变碎以延长塑料商品的寿命。酚类抗氧化剂作为一类环境雌激素，可以在人体内蓄积，有急性毒性和慢性致癌作用，因而抗氧化剂在食品包装材料中的添加量日益引起关注并受到严格的控制。我国国家标准GB9685-2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》和欧盟ROHS指令2011/65/EU等均规定了食品容器、包装材料用添加剂的使用原则、允许使用的添加剂品种、使用范围、最大使用量、最大残留量或特定迁移量。例如，我国GB9685-2016中规定抗氧化剂1076的特定迁移限量(SML)为6mg/kg。鉴于此，建立相关产品的酚类抗氧化剂的快速检测方法，开展定期监测和安全性评估，对于规范行业发展，保证产品质量，保护消费者身体健康和保护环境等具有深远的意义。目前对酚类抗氧化剂的常用分析方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法等。色谱法和色谱质谱联用法具有特异性高、结果准确的优点，但是这两种方法的缺点是样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且需要昂贵的实验室设备，检测成本高。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，该检测卡不但可以同时检测多种酚类抗氧化剂，还具有便捷、快速、直观、成本低的特点，适合现场快速检测。一种检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，所述检测卡上设有顺次搭接粘贴在背衬上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有第一质控线、检测线和第二质控线；所述金标垫上包被有胶体金标记的第一抗体，所述第一抗体为特异性抗酚类抗氧化剂的抗体；所述检测线包被有完全抗原，所述完全抗原为酚类抗氧化剂与载体蛋白的偶联物；所述第一质控线和第二质控线均包被有第二抗体，所述第二抗体可与所述第一抗体特异性结合，且不与所述完全抗原结合。上述检测卡能够同时检测多种酚类抗氧化剂，采用双质控线，结果准确，结构简单，使用方便，适用于酚类抗氧化剂的快速检测。在其中一个实施例中，该检测卡还包括密封袋，所述检测卡套装于所述密封袋内，所述密封袋上设有可拆式覆膜区，所述可拆式覆膜区撕拆后将所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫暴露。在其中一个实施例中，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白中的至少一种；所述第二抗体为羊抗鼠IgG抗体、兔抗鼠IgG抗体或驴抗鼠IgG抗体。在其中一个实施例中，所述完全抗原通过以下方法制备得到：将酚类抗氧化剂、碳酸钾、3-溴丙胺分散至二甲基甲酰胺中，加热回流反应，制得酚类抗氧化剂半抗原，将纯化后的酚类抗氧化剂半抗原、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入二甲基甲酰胺中溶解，搅拌反应；然后称取载体蛋白，溶解在NaHCO3溶液中得到载体蛋白溶液，得载体蛋白溶液，将含有酚类抗氧化剂半抗原的溶液加入上述载体蛋白溶液中反应，即得完全抗原；所述第一抗体通过以下方法制备得到：(a)动物免疫：取上述完全抗原，与等体积的弗氏完全佐剂乳化完全后，腹部注射免疫6-8周龄的雌性Balb/C小鼠，免疫后尾静脉采血，间接ELISA检测血清效价，选择结果最佳的小鼠准备融合；(b)细胞融合：取经选定的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞通过PEG介导进行融合，用间接ELISA法测定上清液进行阳性克隆筛选；(c)第一抗体制备：将阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株，细胞株扩大培养后，接种经降植烷致敏Balb/C小鼠腹腔诱导生产单克隆抗体的腹水；腹水经硫胺粗纯化，再通过辛酸硫胺法纯化得到特异性抗酚类抗氧化剂的第一抗体；所述胶体金标记的第一抗体通过以下方法制备得到：(a)胶体金溶液制备：在水中加入柠檬酸三钠，煮沸后加入氯金酸，继续搅拌加热，当溶液的颜色变为透明的紫红色后停止加热，补水至原体积，冷却，保存备用；(b)胶体金标记物的制备：取已制备好的胶体金溶液，用K2CO3调节胶体金溶液pH；取上述第一抗体，加入到上述胶体金溶液中，室温孵育，离心后弃上清；将所得沉淀用PBS缓冲液溶解稀释，即获得胶体金标记的第一抗体。在其中一个实施例中，所述酚类抗氧化剂为抗氧化剂1076。该抗氧化剂1076的结构式如下：选用抗氧化剂1076制备完全抗原。由于三种抗氧化剂具有共同的母核结构2，6-二叔丁基苯酚，采用抗氧化剂1076制备完全抗原，可确保所制备的完全抗原适用于3种目标化合物的检测，并具有较好的特异性。在其中一个实施例中，所述完全抗原通过以下方法制备得到：将抗氧化剂1076、无水碳酸钾、3-溴丙胺分散至二甲基甲酰胺中，加热回流反应，制得抗氧化剂1076半抗原，将纯化后的抗氧化剂1076半抗原、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入二甲基甲酰胺中溶解，搅拌反应，然后加入载体蛋白，溶解于pH7.0的0.1mol/LNaHCO3中，得载体蛋白溶液，将含有抗氧化剂1076半抗原的溶液加入上述载体蛋白溶液中，边搅拌边缓慢滴加，反应过夜，所得溶液4℃透析3天，即得完全抗原；所述第一抗体通过以下方法制备得到：(a)动物免疫：取上述制得的完全抗原，与等体积的弗氏完全佐剂乳化完全后，腹部皮下多点注射免疫6-8周龄的雌性Balb/C小鼠，免疫7-10天，尾静脉采血，间接ELISA检测血清效价，选择结果最佳的小鼠准备融合；(b)细胞融合：取经选定的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞通过PEG介导进行融合，用间接ELISA法测定上清液进行阳性克隆筛选；(c)第一抗体制备：阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株，细胞株扩大培养后，接种经降植烷致敏BALB/C小鼠腹腔诱导生产单克隆抗体的腹水；腹水经硫胺粗纯化，再辛酸硫胺法纯化得相应抗酚类抗氧化剂化合物的第一抗体；所述胶体金标记的第一抗体通过以下方法制备得到：(a)胶体金溶液制备：在100mL超纯水中加入1mL1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL1％氯金酸，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却，保存备用；(b)胶体金标记的第一抗体的制备：取已制备好的半径为30nm-40nm胶体金溶液，用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.2；按每毫升胶体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测卡上设有顺次搭接粘贴在背衬上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有第一质控线、检测线和第二质控线；所述金标垫上包被有胶体金标记的第一抗体，所述第一抗体为特异性抗酚类抗氧化剂的抗体；所述检测线包被有完全抗原，所述完全抗原为酚类抗氧化剂与载体蛋白的偶联物；所述第一质控线和第二质控线均包被有第二抗体，所述第二抗体可与所述第一抗体特异性结合，且不与所述完全抗原结合。

【技术特征摘要】
1.一种检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测卡上设有顺次搭接粘贴在背衬上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有第一质控线、检测线和第二质控线；所述金标垫上包被有胶体金标记的第一抗体，所述第一抗体为特异性抗酚类抗氧化剂的抗体；所述检测线包被有完全抗原，所述完全抗原为酚类抗氧化剂与载体蛋白的偶联物；所述第一质控线和第二质控线均包被有第二抗体，所述第二抗体可与所述第一抗体特异性结合，且不与所述完全抗原结合。2.根据权利要求1所述的检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，还包括密封袋，所述检测卡套装于所述密封袋内，所述密封袋上设有可拆式覆膜区，所述可拆式覆膜区撕拆后将所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫暴露。3.根据权利要求1所述的检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白中的至少一种；所述第二抗体为羊抗鼠IgG抗体、兔抗鼠IgG抗体或驴抗鼠IgG抗体。4.根据权利要求1-3任一项所述的检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，所述完全抗原通过以下方法制备得到：将酚类抗氧化剂、碳酸钾、3-溴丙胺分散至二甲基甲酰胺中，加热回流反应，制得酚类抗氧化剂半抗原，将纯化后的酚类抗氧化剂半抗原、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入二甲基甲酰胺中溶解，搅拌反应；然后称取载体蛋白，溶解在NaHCO3溶液中得到载体蛋白溶液，得载体蛋白溶液，将含有酚类抗氧化剂半抗原的溶液加入上述载体蛋白溶液中反应，得到酚类抗氧化剂-载体蛋白偶联物，即得完全抗原；所述第一抗体通过以下方法制备得到：(a)动物免疫：取上述完全抗原，与等体积的弗氏完全佐剂乳化完全后，腹部注射免疫6-8周龄的雌性Balb/C小鼠，免疫后尾静脉采血，间接ELISA检测血清效价，选择结果最佳的小鼠准备融合；(b)细胞融合：取经选定的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞通过PEG介导进行融合，用间接ELISA法测定上清液进行阳性克隆筛选；(c)第一抗体制备：将阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株，细胞株扩大培养后，接种经降植烷致敏Balb/C小鼠腹腔诱导生产单克隆抗体的腹水；腹水经硫胺粗纯化，再通过辛酸硫胺法纯化得到特异性抗酚类抗氧化剂的第一抗体；所述胶体金标记的第一抗体通过以下方法制备得到：(a)胶体金溶液制备：在水中加入柠檬酸三钠，煮沸后加入氯金酸，继续搅拌加热，当溶液的颜色变为透明的紫红色后停止加热，补水至原体积，冷却，保存备用；(b)胶体金标记物的制备：取已制备好的胶体金溶液，用K2CO3调节胶体金溶液pH；取上述第一抗体，加入到上述胶体金溶液中，室温孵育，离心后弃上清；将所得沉淀用PBS缓冲液溶解稀释，即获得胶体金标记的第一抗体。5.根据权利要求4所述的检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，所述酚类抗氧化剂为抗氧化剂1076。6.根据权利要求5所述的检测酚类抗氧化剂的免疫层析检测卡，其特征在于，所述完全抗原通过以下方法制备得到：将抗氧化剂1076、无水碳酸钾分散至二甲基甲酰胺中，再加入3-溴丙胺，加热回流反应6-10h，制得抗氧化剂1076半抗原；将经硅胶色谱柱纯化后的抗氧化剂1076半抗原、N-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金凤，寻知庆，王强，叶嘉荣，汪晨霞，陈立伟，侯向昶，吴玉銮，冼燕萍，郭新东，
申请(专利权)人：广州质量监督检测研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44