一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物学领域，公开了一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌（简称Bt）的方法和应用。本发明专利技术提供的方法，通过连续三步不同策略的选择性培养，使样品中Bt细胞的绝对生物量和相对比例均大幅度提高，需要挑取转接培养和镜检的菌落数减少，分离效率大大提高，操作更加简便；同时需要的样品量减少，可实现高通量操作，特别适用于从样品量很小的样品或Bt生物量很小的样品中分离Bt菌株。

A high throughput screening method for isolation of Bacillus thuringiensis and its application

The invention belongs to the field of microbiology, and discloses a method and application for high throughput screening and isolation of Bacillus thuringiensis (Bt). The method provided by the invention can greatly increase the absolute biomass and relative proportion of Bt cells in the sample by selective cultivation with three successive steps and different strategies, reduce the number of colonies that need to be picked up and transferred for culture and microscopic examination, greatly improve the separation efficiency and simplify the operation, and reduce the amount of samples needed to achieve high efficiency. Flux manipulation is especially suitable for isolation of Bt strains from samples with very small sample size or from samples with very small Bt biomass.

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法和应用
本专利技术涉及微生物学领域，具体涉及一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌(简称Bt)的方法和应用。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是目前应用最成功最广泛的生防微生物之一，在生物杀虫剂和转基因抗虫育种方面具有重要的研究和应用价值。从自然界中分离Bt菌株是长期性基础性的工作，是生防资源挖掘最重要的内容。现存分离筛选Bt的方法有以下4种：1.直接分离法直接分离法是细菌通用的分离方法，方法是将样品制备成悬浮液，系列稀释后涂布到LB平板上培养出肉眼可见的单菌落，挑取芽胞杆菌特征的单菌落，转接到芽胞化培养基上培养至芽胞期，通过制片和显微镜观察，筛选具有伴胞晶体的菌落即为Bt菌株。该方法所用的LB培养基对Bt菌株没有选择性，所以受样品中其他芽胞杆菌的影响和干扰比较大，需要挑取鉴定的菌落数量很大，转接培养和制片镜检的工作量都很大，分离效率比较低。2.乙酸钠分离法该方法来源于1987年的一篇文献报道，方法是将样品在含有0.25M乙酸钠的LB液体培养基中培养，由于Bt的芽胞对乙酸钠敏感没有萌发，而其他芽胞杆菌萌发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：步骤一，选择性芽胞化培养：将样品悬液涂布在选择性芽胞化培养基的平板上，28‑30℃培养3‑5天，使其中的Bt细胞选择性扩繁并最终芽胞化；步骤二，选择性萌发抑制培养和高温处理：将所述平板上的培养物收集并制备成芽胞悬液，接种到选择性萌发抑制培养基中，28‑30℃摇床培养4‑8小时，使大部分杂菌萌发生长，然后通过65‑80℃处理30‑60分钟；步骤三，选择性富集培养：将上述高温处理后的培养物涂布在选择性富集培养基的平板上，28‑30℃培养12‑18h，使其长出肉眼可见的单菌落，随机挑取至少12个单菌落，转接到新的选择性富集培养基的平板上，28...

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选分离苏云金芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：步骤一，选择性芽胞化培养：将样品悬液涂布在选择性芽胞化培养基的平板上，28-30℃培养3-5天，使其中的Bt细胞选择性扩繁并最终芽胞化；步骤二，选择性萌发抑制培养和高温处理：将所述平板上的培养物收集并制备成芽胞悬液，接种到选择性萌发抑制培养基中，28-30℃摇床培养4-8小时，使大部分杂菌萌发生长，然后通过65-80℃处理30-60分钟；步骤三，选择性富集培养：将上述高温处理后的培养物涂布在选择性富集培养基的平板上，28-30℃培养12-18h，使其长出肉眼可见的单菌落，随机挑取至少12个单菌落，转接到新的选择性富集培养基的平板上，28-30℃培养3-5天至芽胞期；步骤四，镜检筛选和分离：将所述芽胞化的菌落进行制片镜检，筛选出含有伴胞晶体的菌落，即为分离的Bt菌株；所述的选择性芽胞化培养基，包括：碳酸钙0.05-0.2g/L，氯化锰0.02-0.08mM，磷酸钠缓冲液0.03-0.1M（pH6.8），琼脂粉15-20g/L，pH值6.0-7.5；所述的选择性萌发抑制培养基，包括：氯化钠7.5-15g/L，胰蛋白胨7.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王奋山，姚英娟，刘子荣，徐雪亮，刘小娟，曾绍民，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农业应用微生物研究所江西省农村能源研究中心，
类型：发明
国别省市：江西,36