污水中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基技术

本发明专利技术提供了污水中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基。本发明专利技术的筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法包括：将污水样本在液体BM培养基中扩大培养，经过梯度稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养，初步筛选得到污水中的菌株；其中，所述BM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4‑0.6g NaCl、1‑2g NH4Cl、1‑2g K2HPO4、0.25‑0.75g KH2PO4和0.1‑0.3g MgSO4，加入超纯水至1000mL；每1000mL固体培养基中可在液体培养基基础上含有14‑16g琼脂。本发明专利技术的技术能有效地筛选到对药物降解效率高的工程菌株。

Screening method and culture medium for residual drug degrading bacteria in sewage

The invention provides a screening method and a culture medium for residual drug degrading bacteria in sewage. The method for screening strains of degradable residual drugs in sewage includes: enlarging the sewage sample in liquid BM medium, coating the plate culture on solid BM medium after gradient dilution, and preliminarily screening strains in sewage; wherein the BM medium comprises: every 1000mL liquid medium; Containing 0.4 0.6 g NaCl, 1 2 g NH4Cl, 1 2 g K2HPO4, 0.25 0.75 g KH2PO4 and 0.1 0.3 g MgSO4, adding ultrapure water to 1000 mL, 14 16 g agar per 1000 mL solid medium can be obtained on the basis of liquid medium. The technology of the invention can effectively screen engineering strains with high efficiency of drug degradation.

【技术实现步骤摘要】
污水中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基
本专利技术属于污水中可降解药物的菌株筛选技术，具体而言，本专利技术是关于一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法、该方法中所用到的培养基组合物、该方法所筛选到的污水中残留药物降解菌、以及利用所述降解菌对污水中残留药物进行降解的方法。
技术介绍
据研究报道，目前城市污水处理厂经过处理的污水仍然残留有多种药物，常见的残留药物如头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylicacid)等，这类污水直接排放到环境中，会对自然环境造成很大污染，对人类造成潜在危害。为能去除污水中的残留药物，筛选一些能降解污水中残留药物的微生物是当前生化处理污水的一个研究方向。现有的可降解残留药物的微生物菌种的筛选方法，多为LB培养基方法。然而，实际实验表明，采用LB培养基筛选方法，难以有效地全面筛选到对药物降解效率高的工程菌株，所筛选到的菌株种类有限，基本都是已知的种属，不具有检测残留药物降解性的意义。
技术实现思路
本专利技术主要是提供一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法，还提供了该方法中所用到的培养基组合物，以有效地筛选到对药物降解效率高的工程菌株，用于降解污水中残留药物。一方面，本专利技术提供了一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法，该方法主要是利用培养基BM(BasicMedium)分离污水中的菌株，具体如下：把采集的污水样本分别在液体培养基BM中扩大培养，经过梯度稀释(例如按照1X、3X、5X、10X的稀释比例)后再在固体培养基BM上涂布平板培养，初步筛选得到污水中的菌株。进一步，本专利技术在培养基FM中加入两种不同浓度的污水常见残留药物的混合物，培养后，利用AgilentHP1100液相色谱质谱联用技术检测两种培养基中各自的药物含量，计算得到各个菌株对各种药物的降解效率，从而进一步筛选药物降解菌。具体地，本专利技术提供的筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法包括：将污水样本在液体BM培养基中扩大培养，经过梯度稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养，初步筛选得到污水中的菌株；其中，所述BM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.25-0.75gKH2PO4和0.1-0.3gMgSO4，加入超纯水至1000mL；每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.25-0.75gKH2PO4、0.1-0.3gMgSO4和14-16g琼脂，加入超纯水至1000mL。根据本专利技术的具体实施方法，本专利技术的方法还进一步包括：在FM(FermentationMedium)培养基中加入两种以上不同浓度的污水残留药物的混合物，接种初步筛选得到的菌种，培养24h以上后，利用AgilentHP1100液相色谱质谱联用技术检测培养基中药物含量，进一步筛选除药物降解菌。根据本专利技术的具体实施方法，本专利技术的方法中，所述FM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.4-0.6gKH2PO4、0.1-0.3gMgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏，加入超纯水至1000mL。根据本专利技术的具体实施方法，本专利技术的方法中，所述污水残留药物选自以下中的至少两种：头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylicacid)。在本专利技术的一更具体实施方案中，本专利技术的方法包括：取1-2mL从城市污水处理厂采集的污水样本，加入到15-20mLBM液体培养基中，调节转速为150-200RPM，温度为26-30℃，放置在摇床上培养3-5天；将富集的培养液分别按照1X、3X、5X、10X的稀释比例，再次加入到BM液体培养基中培养24-48h；之后将各个梯度的培养液分别涂布于BM固体培养基上，在26℃的条件下倒置培养3-5天；将培养的菌株进一步在新的平板上分离纯化，得到初步筛选的菌株，根据颜色、形态和16SrRNA基因的序列比对结果，将分离纯化的菌分类。更进一步地，该方法还包括：选取以下药物中的至少两种：头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylicacid)，混合后，按照0.1ppm和1ppm两种浓度分别加入灭过菌的FM液体培养基中；在无菌操作条件下，将初步筛选的菌株富集培养后分别接种于上述加入残留药物的灭过菌的FM培养基中，26-30℃，150-200RPM培养3-5天；培养得到的混合液离心，之后用OasisHLB纯化柱和AgilentHP1100液相色谱质谱串联法分离和检测药物含量，筛选出药物降解菌。本专利技术相较于传统的LB培养基方法，能够分离得到更多具有药物抗性的菌株，极大地提高了污水残留药物地降解效率。另一方面，本专利技术还提供了一种用于筛选污水中可降解残留药物的菌株的培养基，该培养基包括液体和/或固体形式的改进的BM培养基，所述改进的BM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.25-0.75gKH2PO4和0.1-0.3gMgSO4，加入超纯水至1000mL；每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.25-0.75gKH2PO4、0.1-0.3gMgSO4和14-16g琼脂，加入超纯水至1000mL。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的培养基还包括液体形式的改进的FM培养基，所述改进的FM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.4-0.6gKH2PO4、0.1-0.3gMgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏，加入超纯水至1000mL。另一方面，本专利技术还提供了一种可降解污水中残留药物的菌株，其是按照本专利技术所述的方法筛选得到的。另一方面，本专利技术还提供了利用所述降解菌对污水中残留药物进行降解的方法。本专利技术的有益效果：(一)与传统用LB培养基方法相比，本专利技术所用的培养基可以分离得到更加丰富的菌株。在本专利技术的一具体实施例中，从同样采自香港沙田污水处理厂的污水样品中，本专利技术共分离得到22株细菌，而同时用LB培养基，只分离得到5株菌，BM方法是LB方法的4-5倍。一定程度上可以提高污水中药物抗性菌株和可降解菌株分离效率。(二)本专利技术填补了污水中残留药物对污水处理工程菌株性能的效应的研究空白。本专利技术设置不同的残留药物浓度，对污水处理工程菌的药物降解性能进行研究，结果表明不同的药物组合下微生物的药物降解性能有很大不同。用本专利技术改进的培养基方法能够得到药物降解效率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法，该方法包括：将污水样本在液体BM培养基中扩大培养，经过稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养，初步筛选得到污水中的菌株；其中，所述BM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4‑0.6g NaCl、1‑2g NH4Cl、1‑2g K2HPO4、0.25‑0.75g KH2PO4和0.1‑0.3g MgSO4，加入超纯水至1000mL；每1000mL固体培养基中含有0.4‑0.6g NaCl、1‑2g NH4Cl、1‑2g K2HPO4、0.25‑0.75g KH2PO4、0.1‑0.3g MgSO4和14‑16g琼脂，加入超纯水至1000mL。

【技术特征摘要】
2016.12.13 CN 20161114609491.一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法，该方法包括：将污水样本在液体BM培养基中扩大培养，经过稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养，初步筛选得到污水中的菌株；其中，所述BM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.25-0.75gKH2PO4和0.1-0.3gMgSO4，加入超纯水至1000mL；每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.25-0.75gKH2PO4、0.1-0.3gMgSO4和14-16g琼脂，加入超纯水至1000mL。2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：在FM培养基中加入两种以上不同浓度的污水残留药物的混合物，接种初步筛选得到的菌种，培养24h以上后，利用AgilentHP1100液相色谱质谱联用技术检测培养基中药物含量，进一步筛选除药物降解菌。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述FM培养基包括：每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6gNaCl、1-2gNH4Cl、1-2gK2HPO4、0.4-0.6gKH2PO4、0.1-0.3gMgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏，加入超纯水至1000mL。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述污水残留药物选自以下中的至少两种：头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylicacid)。5.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：取1-2mL从城市污水处理厂采集的污水样本，加入到15-20mLBM液体培养基中，调节转速为150-200RPM，温度为26-30℃，放置在摇床上培养3-5天；将富集的培养液分别按照1X、3X、5X、10X的稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：林忠华，栗艳霞，林群声，
申请(专利权)人：香港城市大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44