猫冠状病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种猫冠状病毒(FCoV)荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法，所述猫冠状病毒荧光EMA检测引物组包含上、下游引物和探针，所述试剂盒包括以下内容：复溶液、含引物的冻干酶管、阳性质控品、阴性质控品。所述检测包含使用所述试剂盒进行常温核酸扩增技术，通过M‑MLV逆转录酶、Rnase抑制剂、DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37‑45℃恒温条件下，10‑30分钟内使待检RNA逆转录成cDNA，并将cDNA扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检RNA的快速检定。本发明专利技术操作简单、时间短、仪器要求低，适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。

Primers, kits and detection methods for detection of feline coronavirus by fluorescent EMA

The invention relates to a fluorescent EMA detection primer group, a kit and a detection method for cat coronavirus (FCoV). The fluorescent EMA detection primer group of the cat coronavirus contains upper and lower primers and probes. The kit comprises the following contents: compound solution, lyophilized enzyme tube containing primers, positive quality control substance and negative control substance. The assay consists of a room temperature nucleic acid amplification technique using the kit. Enzyme-catalyzed reactions such as M_MLV reverse transcriptase, Rnase inhibitor, DNA helicase, single-stranded DNA binding protein, DNA polymerase, etc. can reverse-transcribe the RNA to a cDNA within 10_30 minutes at 37_45_C and amplify the cDNA into millions. With the fluorescence detection technology, we can achieve rapid verification of RNA. The invention has the advantages of simple operation, short time and low instrument requirement, and is suitable for rapid diagnosis of pet infectious diseases.

【技术实现步骤摘要】
猫冠状病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种猫冠状病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法。
技术介绍
猫冠状病毒(FelineCoronavirus，FCoV)：据统计，家庭饲养的猫有25％～40％为冠状病毒阳性，而在大型猫舍或是繁殖猫舍中，阳性率达到80％～100％。虽然感染后可能完全没有临床症状，但是可能会发生死亡率非常高的猫传染性腹膜炎，本病常发于四岁以下的年轻成猫，尤其常发于群聚饲养的猫群。目前，对猫传染性腹膜炎无有效的疫苗预防，也无有效的药物治疗。因此，对于FCoV的管理与控制，准确的诊断是至关重要的。目前，已有少数针对猫冠状病毒(FCoV)核酸的检测方法，主要包括PCR技术和实时荧光定量PCR技术，对猫冠状病毒(FCoV)核酸的检测灵敏度和特异性有了很大提升。但PCR技术和实时荧光定量PCR技术均需要配备价格高昂的PCR仪或实时荧光定量PCR仪，因此无法用于基层和现场检测，目前并未得到广泛应用。因此，怎样能够满足基层检测用时少、技术和仪器要求低、操作简单方便的需求，成为业内急需解决的问题。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术提供一种猫冠状病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒及检测方法，特异性强、准确率高，操作简单、时间短、仪器要求低，能够快速、准确、低成本地检测猫冠状病毒。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：猫冠状病毒荧光EMA检测引物组，所述猫冠状病毒荧光EMA检测引物组包含上、下游引物和探针，所述上游引物序列是：5’-TCAAGGTCTGGTTCTCAGTCTAG-3’；所述下游引物序列是：5’-GTTTTCTTCCAGGTGTGTTTGT-3’；所述探针序列是5’-TTTTCTTCCAGGTGTGTTTG/i6-FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/TAGGTGT-3’C3Spacer。其中：“i6-FAMdT”指6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”指带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3Spacer”指3’羟基封闭。所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。本专利技术还提供猫冠状病毒荧光EMA检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：(1)复溶液；(2)含引物的冻干酶管；所述引物包含上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-TCAAGGTCTGGTTCTCAGTCTAG-3’；所述下游引物是：5’-GTTTTCTTCCAGGTGTGTTTGT-3’；所述探针是5’-TTTTCTTCCAGGTGTGTTTG/i6-FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/TAGGTGT-3’C3Spacer；(3)阳性对照品；(4)阴性对照品。其中，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含0.1-2M的MgAc2840μL、0.1-2MpH8.0的Tris-Ac3.00mL、0.1-2M的DTT150μL、无RNase水26.01ml。优选的，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含1-2M的MgAc2840μL、1-2MpH8.0的Tris-Ac3.00mL、1-2M的DTT150μL、无RNase水26.01ml。其中，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1000～3000ng/ul的单链DNA结合蛋白178μL、10-100ng/ul的ATP再生蛋白75μL、200-2000ng/ul的DNA解旋酶259μL、100-1000ng/ul的DNA聚合酶75μL、100-1000ng/ul的DNA限制性内切酶200μL、10-300ng/ul的辅助蛋白30μL、50-500ng/ul的M-MLV逆转录酶400μL、500-5000ng/ul的RNase抑制剂10μL、10-100μM的上游引物5μL、10-100μM的下游引物5μL、10-100μM的探针15.5μL、1-10M的磷酸肌酸钠144μL、10-100mM的ATP144μL、5-50mM的dNTP62μL、0.1-2MpH8.0的Tris-Ac21.57ul、海藻糖0.14g、KAc0.02g、纯化水360μL。优选的，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1500-2500ng/ul单链DNA结合蛋白178μL、20-50ng/ulATP再生蛋白75μL、300-600ng/ulDNA解旋酶259μL、300-600ng/ulDNA聚合酶75μL、300-600ng/ulDNA限制性内切酶200μL、50-100ng/ul辅助蛋白30μL、100-200ng/ulM-MLV逆转录酶400μL、1000-2000ng/ulRNase抑制剂10μL、100μM上游引物5μL、100μM下游引物5μL、10μM探针15.5μL、1M磷酸肌酸钠144μL、80-100mMATP144μL、25mMdNTP62μL、pH8.0的1-2MTris-Ac21.57ul、海藻糖0.14g、KAc0.02g、纯化水360μL。其中，所述阴性对照品为无RNase水空白对照。其中，所述阳性对照品为猫冠状伪病毒，浓度是1μg/mL。本专利技术还提供一种猫冠状病毒的检测方法，所述检测方法采用权利要求3所述的猫冠状病毒荧光EMA检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述检测方法包括以下步骤：(1)提取样本中病毒RNA；(2)使用权利要求3所述的检测试剂盒，取10μL复溶液及10μL步骤(1)所得病毒RNA，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；(3)将复溶的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；(4)结果分析。所述结果分析是：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。优选的，所述样本可取自猫鼻、咽拭子、粪便、直肠拭子；或者，所述样本可取自猫胸、腹腔积液、脑脊液、房水、肾肉芽肿。本专利技术使用常温核酸扩增技术，通过M-MLV逆转录酶、Rnase抑制剂、DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使待检RNA逆转录成eDNA，并将cDNA扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检RNA的快速检定。本专利技术的引物序列是这样得到的：从NCBI中下载猫冠状病毒基因组序列(序列号JQ408980.1)，通过oligo7软件设计引物，以含目的序列的质粒为模板，通过凝胶电泳筛选最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到质粒6(10-4ng/μL)、副反应尽量少。筛选好引物后，以上下游引物中间的序列设计一条探针。本专利技术的引物和探针的筛选步骤如下：1：先用在线软件分析猫冠状病毒RNA(JQ408980.1)的结构，http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi，根据二级结构示意图，找出容易配对区域，见图3；2：根据选取区域，按照以下规则进行引物设计，a)引物长度在20-30碱基之间；b)引物G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猫冠状病毒荧光EMA检测引物组，其特征在于，所述猫冠状病毒荧光EMA检测引物组包含上、下游引物和探针，所述上游引物序列是：5’‑TCAAGGTCTGGTTCTCAGTCTAG‑3’；所述下游引物序列是：5’‑GTTTTCTTCCAGGTGTGTTTGT‑3’；所述探针序列是5’‑TTTTCTTCCAGGTGTGTTTG/i6‑FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/TAGG TGT‑3’C3 Spacer。

【技术特征摘要】
1.猫冠状病毒荧光EMA检测引物组，其特征在于，所述猫冠状病毒荧光EMA检测引物组包含上、下游引物和探针，所述上游引物序列是：5’-TCAAGGTCTGGTTCTCAGTCTAG-3’；所述下游引物序列是：5’-GTTTTCTTCCAGGTGTGTTTGT-3’；所述探针序列是5’-TTTTCTTCCAGGTGTGTTTG/i6-FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/TAGGTGT-3’C3Spacer。2.如权利要求1所述的猫冠状病毒荧光EMA检测引物组，其特征在于，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。3.猫冠状病毒荧光EMA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下内容：(1)复溶液；(2)含引物的冻干酶管；所述引物包含上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-TCAAGGTCTGGTTCTCAGTCTAG-3’；所述下游引物是：5’-GTTTTCTTCCAGGTGTGTTTGT-3’；所述探针是5’-TTTTCTTCCAGGTGTGTTTG/i6-FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/TAGGTGT-3’C3Spacer；(3)阳性对照品；(4)阴性对照品。4.如权利要求3所述的猫冠状病毒荧光EMA检测试剂盒，其特征在于，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含0.1-2M的MgAc2840μL、0.1-2MpH8.0的Tris-Ac3.00mL、0.1-2M的DTT150μL、无RNase水26.01ml。5.如权利要求3所述的猫冠状病毒荧光EMA检测试剂盒，其特征在于，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1000～3000ng/ul的单链DNA结合蛋白178μL、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭卓，胡振新，郜安国，
申请(专利权)人：苏州点晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32