牛轮状病毒的RPA-侧流层析检测引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种RPA‑侧流层析检测BRV的引物、探针及试剂盒，所述试剂盒中包含有由用于通过RPA技术检测BRV的引物探针液，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术所使用的引物探针组RPA扩增效果好，条带特异性强，与其他病毒无交叉反应，在检测区的有强阳性反应，增加了检测的灵敏性。本发明专利技术系首次采用RPA‑侧流层析技术建立快速检测牛BRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

Detection of bovine rotavirus by RPA- lateral stream chromatography primers, probes and kits

The present invention discloses a primer, probe and kit for detecting BRV by RPA_lateral flow chromatography. The kit contains a primer probe liquid for detecting BRV by RPA technique. The forward primer sequence of the primer is shown as SEQ ID No.1, the reverse primer sequence is shown as SEQ ID No.2, and the probe sequence is shown as SEQ ID No.3. Show. The primer probe group used in the invention has good amplification effect, strong band specificity, no cross reaction with other viruses, strong positive reaction in the detection area, and increased the detection sensitivity. The invention is the first time to establish a rapid detection method for bovine BRV by RPA_lateral flow chromatography. The method can be used for clinical on-site detection through specificity and sensitivity evaluation, and provides a sensitive and reliable new method for on-site detection of BRV.

【技术实现步骤摘要】
牛轮状病毒的RPA-侧流层析检测引物、探针及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePloymeraseAmplification，RPA)并结合侧流层析技术(LateralFlowAssay)检测牛轮状病毒的引物、探针及其试剂盒。
技术介绍
牛轮状病毒腹泻是由轮状病毒感染(Bovinerotavirus，BRV)引起的一种腹泻病，主要感染1～7日龄的犊牛，可引起犊牛消化道机能紊乱，以精神沉郁、厌食、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为主要临床特征。由于轮状病毒引起的肠细胞损伤更有利于产毒素性大肠杆菌和沙门氏菌等病源微生物的附着和感染，这种混合感染和继发感染将导致更严重的腹泻和更高的死亡率。随着我国奶牛养殖集约化规模化程度的提高，犊牛腹泻常年散发甚至爆发，发病率为16.5～91.7％，死亡率为20～50％，由于治疗成本的增加和生长发育率的降低，造成了巨大的经济损失，严重影响了我国奶牛养殖业的健康持续发展。目前该病的诊断方法主要有病原分离、PCR方法等技术，由于这些方法需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因而亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为临床现场检测及疫情流行病学调查提供新一代的检测技术与手段。重组酶聚合酶扩增(recombinaseploymeraseamplification,RPA)技术是不同于PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA配对，在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模板分子得到大约1012扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20余min即可得到扩增产物(Forgetetal.,2012)。RPA可以与侧向流动免疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5min左右就能目测结果，肉眼判读。本专利技术系首次采用RPA技术建立快速检测BRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
技术实现思路
针对RPA-侧流层析技术应用于BRV检测领域的空白，本专利技术提供了一种检测BRV的RPA-侧流层析引物探针组合物、试剂盒及一种基于RPA-侧流层析检测BRV的方法。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术目的之一在于提供一种RPA-侧流层析检测BRV引物和探针组合物，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。正向引物BRV-F：5’-AAAGTTAGGACCAAGGGAGAACGTAGCAGT-3’，(SEQIDNo.1)；反向引物BRV-R：5’-[Biotin]CACATCATACAATTCTAATCTAACATGCACCTAC-3’，(SEQIDNo.2)；探针序列BRV-P：5’-[FAM]ACACGGTAGTGGATTACGTCAATCAGATAATT[dSpacer]AGACAATGTCCAAAAGA[C3-spacer]-3’；(SEQIDNo.3)。需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本专利技术的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。本专利技术相应的保护上述引物和探针组合在制备牛轮状病毒检测试剂中的应用。本专利技术目的之二在于提供一种检测BRV的试剂盒，该试剂盒中包含上述引物和探针组成的引物探针液。优选的，所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，检测探针的终浓度为0.12μmol/L，扩增BRV核苷酸序列片段为SEQIDNO.4。优选的，该试剂盒中还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析检测试剂。优选的，所述标准阳性质粒为T3-BRV-VP7，用于BRV检测的阳性对照，检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。优选的，所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×PBS+0.1％Tween20)。优选的，所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。所述的缓冲液、酶扩增八联管、反应驱动液于市场购买得到。具体的，一种检测BRV的试剂盒，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、BRV的引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或以阳性标准质粒为阳性对照分别为1μL或以无菌双蒸水为空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。本专利技术的目的之三在于提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BRV的方法，步骤如下：(1)提取待测样本的总RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA；(2)设计用于BRV检测的引物和探针，以cDNA为模板，进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。优选的，上述扩增反应，反应体系为50μL：10×PCRBufferII(Mg2+Plus)5μL、2.5mMdNTPMixture8μL、rTaq0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，分别加入10μmol/L的引物VP7-F和VP7-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL；反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃40s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。优选的，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有BRV核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有BRV核酸。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术系首次采用RPA-侧流层析技术建立快速检测牛BRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。本专利技术的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。(2)采用本专利技术的引物和探针组合，通过RPA技术对BRV临床样本进行了检测，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RPA‑侧流层析检测BRV的引物和探针组合，其特征在于，正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种RPA-侧流层析检测BRV的引物和探针组合，其特征在于，正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备牛轮状病毒的检测试剂中的应用。3.一种检测BRV的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含由权利要求1所述的引物和探针组成的引物探针液。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针液的组成：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，探针的终浓度为0.12μmol/L，扩增BRV核苷酸序列片段为SEQIDNO.4。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒为T3-BRV-VP7，由SEQIDNO.5和SEQIDNO.6扩增的核苷酸序列片段SEQIDNO.7与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、BRV各种型相应的引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或以标准阳性质粒为阳性对照分别为1μL或以无菌双蒸水为空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。8.一种应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，王洪梅，贺文琦，赵贵民，侯佩莉，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37