本发明专利技术涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，首先提取待测样品的基因组DNA；再根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针，最后采用设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。本发明专利技术的检测方法检测灵敏度高且特异性好，可以检测到的最低拷贝数为7，用时短且不会出现假阳性的情况，可应用于我国对虾养殖中的分子疾病检测和早期预警，具有良好的应用前景。
A quantitative method for detection of infectious hypodermic and hematopoietic necrosis virus in shrimp
The invention relates to a quantitative detection method for infectious subcutaneous and hematopoietic tissue necrosis virus of penaeid shrimp, in which the genomic DNA of the tested sample is extracted firstly, the primers and TaqMan probes are designed according to the relevant sequences of IHHNV, and the genomic DNA of the tested sample is detected by fluorescence quantitative PCR with the designed primers and TaqMan probes. The detection method of the invention has high detection sensitivity and good specificity, can detect the lowest copy number of 7, and can be used for short time without false positive. The method can be used for molecular disease detection and early warning in shrimp culture in China, and has good application prospect.
【技术实现步骤摘要】
一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法
本专利技术一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，属于分子生物学
技术介绍
传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是单股DNA小病毒。是目前已知的对虾病毒中颗粒最小的一种，病毒粒(Virion)直径约22nm(纳米)，无套膜(Nonenveloped)，20面体(Icosahedron)对称的球状颗粒.IHHNV感染对虾的部位，包括外胚层组织，如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节；以及中胚层器官，如造血组织、触角腺、性腺、淋巴器官、结缔组织和横纹肌。在宿主细胞核内形成包涵体。在白对虾(Litopenaeusvannamei)则引起矮小畸形症候群(Runt-deformitysyndrome，简称RDS)，成长缓慢且不齐，额角弯向一侧，第六腹节及尾扇变形或变小，造成高达50％的经济损失。传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV)容易被忽略，因为IHHNV感染南美白对虾，不会导致死亡。南美白对虾在感染IHHNV之后，有可能终身带原，并透过垂直传染途径感染子代，或透过食物链或互相残食或水体而引起水平感染，其中以吃食病虾的传染性最高。IHHNV自1983年在夏威夷首次爆发至今，目前已经公布全基因组序列有夏威夷株、印度株、韩国株、中国福建株、中国赣榆株、中国射阳株。为了防止IHHNV的爆发，目前可以采取以下几个措施防范：严格筛选IHHNV-free的对虾作为亲本来孵育虾苗；受精卵和幼体必须严格消毒；虾苗养殖场的水源、设备、管道等等需要定期彻底消毒，以及需要一定的生物安全防护系统；在养殖塘中放养Specific-Pathogen-Free(SPF)虾苗，定期的对虾塘进行IHHNV生物诊断等。IHHNV的诊断技术有两种，即组织学检测和分子生物学诊断。目前的分子生物学诊断方法主要有PCR方法、套式PCR、荧光定量染料法、LAMP法等。PCR方法具有高灵敏度的优点，但一般PCR产物需要通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观测结果，不仅需要多种仪器而且费时费力却危害身体健康。套式PCR则需要两对引物，费时长；荧光定量染料法则根据原理可知会有假阳性且成本较高等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法。技术方案本专利技术人采用TaqMan探针法对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒进行定量检测，该检测方法比普通的PCR灵敏度更高，也克服了常规PCR和SYBRGreenPCR的许多缺点。目前在水产养殖动物的常规病原体检测中建立快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。具体方案如下：一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针：上游引物序列：5'-CGACTTTATTGAAGGGACTC-3'下游引物序列：5'-AGTCTTCTTGGTTGTGGTTT-3'TaqMan探针的序列为：5'-CGCCTTCCGTCCATTTCGT-3'；(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。进一步，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括2×SuperRealcolorPreMix10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探针0.4μL，ddH2O7.4μL，提取的基因组DNA1μL。进一步，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，57℃退火60s，采集荧光信号，40个循环。有益效果：本专利技术提供了一种利用TaqMan探针对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒进行定量检测的方法，该检测方法检测灵敏度高且特异性好，可以检测到的最低拷贝数为7，用时短且不会出现假阳性的情况，可应用于我国对虾养殖中的分子疾病检测和早期预警，具有良好的应用前景。附图说明图1为实施例1传染性皮下及造血组织坏死病毒不同浓度梯度的扩增曲线；图2为实施例1的标准曲线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例1一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA：样品采集48份新鲜的虾肌肉样品，采集后迅速放入酒精中4℃保存。病毒核酸提取：采用的天根公司的DNA提取试剂盒，步骤参考试剂盒中的说明书的方法进行。(2)根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针：引物探针的设计在NCBI上查找传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)的序列，通过在线序列比对软件MultAlin多重比对，分析出序列的保守区与特异性区域，确定引物及探针，然后用PrimerPremier5进行引物探针的评估，进行初步筛选。合成引物及探针后用PCR验证是否扩增目的片段以及扩增的特异性，进一步确定可行的引物及探针。上游引物序列：5'-CGACTTTATTGAAGGGACTC-3'下游引物序列：5'-AGTCTTCTTGGTTGTGGTTT-3'TaqMan探针的序列为：5'-CGCCTTCCGTCCATTTCGT-3'；(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。所述荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括2×SuperRealcolorPreMix10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探针0.4μL，ddH2O7.4μL，提取的基因组模板DNA1μL。所述荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，57℃退火60s，采集荧光信号，40个循环。图1为传染性皮下及造血组织坏死病毒不同浓度梯度的扩增曲线，曲线从左到右的浓度依次为7*10-5copies/μL、7*10-6copies/μL、7*10-7copies/μL、7*10-8copies/μL、7*10-9copies/μL、7*10-10copies/μL、7*10-11copies/μL、7*10-12copies/μL。图2为本专利技术实施例1的标准曲线，是用不同浓度的阳性标准品跑荧光定量PCR，然后根据CT值和浓度作出的。该曲线y＝-3.77x+39.72(r＝0.994)，y：扩增实验中所得到的CT值，x：所对应的模板浓度取对数。荧光定量PCR检测结束后，无目的条带的为阴性，有明显的目的条带的为阳性。本实施例检测出7个阳性，检出率为14.58％。对比例1采用常规PCR方法对实施例1的48份虾苗进行检测，所用引物与实施例1一致，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，延伸温度72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。该方法检测出4个阳性，检出率为8.3％。对比例2采用SYBRGreenⅠ对实施例1的48份虾苗进行检测，所用引物与实施例1一致，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性15s，61℃退火30s，40个循环；溶解曲线：95℃15s，55℃15s，95℃15s。该方法检测出5个本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针：上游引物序列：5'‑CGACTTTATTGAAGGGACTC‑3'下游引物序列：5'‑AGTCTTCTTGGTTGTGGTTT‑3'TaqMan探针的序列为：5'‑CGCCTTCCGTCCATTTCGT‑3'；(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。
【技术特征摘要】
1.一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针：上游引物序列：5'-CGACTTTATTGAAGGGACTC-3'下游引物序列：5'-AGTCTTCTTGGTTGTGGTTT-3'TaqMan探针的序列为：5'-CGCCTTCCGTCCATTTCGT-3'；(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。2.如权利要求1所述对...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红，李云，于晓丹，戴习林，朱其建，周微微，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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