一种三链DNA分子信标结合纳米孔技术联用的抗体检测方法技术

本发明专利技术公开了一种三链DNA分子信标结合纳米孔技术联用的抗体检测方法。发明专利技术人首先设计并合成了用于检测抗体的三链DNA分子信标，当抗体与分子信标结合后，分子信标结构被破坏，释放探针；抗体‑抗体捕捉DNA分子复合物由于体积过大而无法穿越纳米孔，而探针穿越纳米孔将会产生特征电流信号，该信号特异性极强，可以准确地实现分子指认，避免了背景干扰的问题。此外，分子信标独特的热力学和动力学性质与纳米孔这种单分子技术相结合，实现了对变价抗体的高灵敏度检测。不仅如此，本发明专利技术的方法还具有操作简单，试剂消耗量极少，无需借助大型仪器等优点。

An antibody detection method combined with three strand DNA molecular beacon combined with nanopore Technology

The invention discloses an antibody detection method combined with three strand DNA molecular beacon combined with nanopore technology. Inventors first designed and synthesized three-stranded DNA molecular beacons for detecting antibodies. When antibodies bind to molecular beacons, the molecular beacon structure is destroyed and probes are released; antibodies capture DNA molecular complexes that are too large to penetrate nanopores, and probe penetration through nanopores produces characteristic current signals. The signal is highly specific and can accurately identify the molecules and avoid background interference. In addition, the unique thermodynamic and kinetic properties of molecular beacons are combined with the single molecular technology of nanopore to achieve high sensitivity detection of variational antibodies. Moreover, the method of the invention has the advantages of simple operation, minimal reagent consumption and no need of large-scale instruments.

【技术实现步骤摘要】
一种三链DNA分子信标结合纳米孔技术联用的抗体检测方法
本专利技术涉及一种三链DNA分子信标结合纳米孔技术联用的抗体检测方法。
技术介绍
抗体作为一种重要的生化指标，其快速灵敏检测不仅对于疾病诊断意义重大，也是疗效观察和疾病预防的重要手段。目前普遍采用的抗体检测技术主要有酶联免疫吸附法和蛋白质印迹法两种。但这两种方法不仅操作复杂，消耗大量试剂，而且得到的结果通常也都是半定量结果。近些年随着纳米技术的飞速发展，相继开发出各种基于纳米材料以实现高灵敏度、高选择性检测抗体的方法。但仍需要借助大型仪器且过程繁琐。因此发展简单、高效的抗体检测方法变得愈发迫切。由于DNA具有碱基互补配对，碱基或链末端上可进行多种修饰等优势而可以被设计成各种功能不同的纳米机器。2015年，Ricci等人利用末端修饰了抗原和荧光基团的分子信标结构实现了地高辛抗体(二价)的高灵敏度快速简单检测。随后基于分子信标修饰荧光基团的方法又实现了多种抗体(二价)的检测，使该方法广为人知，但对于变价抗体的检测效果仍然不好。此外，由于该方法依赖于光学信号，因此存在着光漂白、荧光寿命短、背景干扰等问题，尤其是背景干扰极易得出假阳性结论。因此研究开发出基于分子信标的高灵敏度、高选择性、低背景干扰的抗体检测方法极有利于医疗事业发展。纳米孔单通道技术是自二十世纪九十年代中期起在电生理学研究的基础上发展起来的新兴检测手段。所谓纳米孔就是孔径尺寸在纳米尺度的孔道，通常为1-100纳米。当两个充满电解液的相互绝缘的隔室通过纳米级孔道连通，在外加电场作用下，溶液中的电解质离子定向迁移并穿过纳米孔从而产生电流，经膜片钳系统测量、放大和转换后被记录。当溶液中存在待检测物质时，该物质在扩散作用或电压驱动下穿越纳米孔，此时孔道内通过的离子数目由于待测物的占据而产生变化，从而导致记录到的电流发生改变，电流信号包含两个特征量：电流阻滞振幅(amplitude)和电流阻滞时间(dwelltime)，从中可以分析得出丰富的物性信息：物质的种类、结构、构象变化和分子组成等。通常来讲，生物型纳米孔的灵敏度和信噪比要比人造材料纳米孔好得多，因此生物纳米孔更有利于实现高灵敏度检测。但是生物纳米孔是通过质粒表达得来的，其几何尺寸已经固定，因此只有大小与其匹配的分子才可以穿越。抗体的尺度通常在十纳米左右，因此无法穿越αHL。2011年JACS发表了基于核酸适体结合HL纳米孔检测可卡因的工作。当核酸适体结合可卡因后会形成Y型复合结构。该结构无法穿越αHL纳米孔而发生长时间电流堵塞，也正是利用了这种堵塞电流信号实现了可卡因快速检测。但是堵塞信号非常不利于高灵敏度检测，因为其信号特征性低，背景干扰较强。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种三链DNA分子信标结合纳米孔技术联用的抗体检测方法。本专利技术首先提供了一种用于检测目标抗体的分子组合，包括探针分子和抗体捕获分子；所述探针分子是将瓜环修饰于单链DNA分子I的5’末端得到的；单链DNA分子I中，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区A；所述抗体捕获分子由单链DNA分子II和两个抗原分子组成；单链DNA分子II位于中间，单链DNA分子II的两个末端分别连接一个与目的抗体对应的抗原分子；DNA分子II中，5’端具有由n个核苷酸组成的结合区B，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区C；结合区B和结合区C为反向序列；结合区B与结合区A为反向互补序列。本专利技术还保护一种用于检测目标抗体的复合物，由探针分子和抗体捕获分子共孵育形成；所述探针分子是将瓜环修饰于单链DNA分子I的5’末端得到的；单链DNA分子I中，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区A；所述抗体捕获分子由单链DNA分子II和两个抗原分子组成；单链DNA分子II位于中间，单链DNA分子II的两个末端分别连接一个与目的抗体对应的抗原分子；DNA分子II中，5’端具有由n个核苷酸组成的结合区B，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区C；结合区B和结合区C为反向序列；结合区B与结合区A为反向互补序列。所述探针分子和抗体捕获分子共孵育的反应条件具体可为4℃、2h。所述探针分子和抗体捕获分子等摩尔混合后共孵育。以上任一所述n为6-10之间的任意自然数。以上任一所述单链DNA分子I的长度为18-22bp。以上任一所述单链DNA分子II的长度为33-41bp。以上任一所述n为8。以上任一所述单链DNA分子I的长度为20bp。以上任一所述单链DNA分子II的长度为37bp。以上任一所述能够将瓜环与DNA分子连接的化合物为二茂铁。以上任一所述单链DNA分子I中，除结合区A以外的核苷酸均为C。所述结合区A具体可为GAGAGAGA。以上任一所述单链DNA分子II中，所述结合区B和结合区C中间由N个相同碱基连接。所述N为19-23之间的任意自然数。所述N具体可为21。所述结合区B和结合区C中间由N个T连接。所述结合区B具体可为TCTCTCTC。所述结合区C具体可为CTCTCTCT。以上任一所述单链DNA分子I具体可如序列表的序列1所示。以上任一所述单链DNA分子II具体如序列表的序列2所示。以上任一所述探针分子中，瓜环借助连接臂修饰于单链DNA分子I的5’末端。所述连接臂具体由磷酸基团、三氮唑和二茂铁形成。以上任一所述探针分子中，以下各个元件依次连接：单链DNA分子I、磷酸基团、三氮唑、二茂铁和瓜环。瓜环通过主客体超分子作用与二茂铁连接。以上任一所述瓜环具体可为七元瓜环。以上任一所述探针分子的制备方法具体包括如下步骤：(a1)取3.3μL单链DNA分子I溶液(溶剂为水，单链DNA分子I的浓度为100μM)，1.2μL去离子水，2μL叠氮二茂铁溶液(溶剂为乙腈，叠氮二茂铁的浓度为200mM)，1μL抗坏血酸钠溶液(溶剂为水，抗坏血酸钠的浓度为20mM)，0.5μL硝酸铜溶液(溶剂为水，硝酸铜的浓度为20mM)，2μLHEPES缓冲液(200mM)混合，混合溶液共10μL。(a2)将步骤(a1)得到的混合溶液室温下涡旋反应2h，然后加入2μLEDTA溶液(100mM)终止反应。(a3)完成步骤(a2)后，使用Microbio-spin6凝胶排阻色谱柱，按说明书操作进行除盐。(a4)将步骤(a3)除盐后得到的样品加入10μL瓜环{Q[7]}(5mM)孵育2h，得到探针。本发还保护一种系统，包括任一所述的分子组合和样品池系统；所述样品池系统包括两个隔室，两个隔室聚四氟乙烯膜分隔；所述聚四氟乙烯膜中间具有一个直径为100-150μM的通孔，所述通孔被磷脂双分子层充满，在所述磷脂双分子层中存在一个由α-溶血素七聚体蛋白形成的纳米孔；样品池系统中应用Ag/AgCl电极组成闭合回路。本专利技术还保护一种系统，包括任一所述的复合物和样品池系统；所述样品池系统包括两个隔室，两个隔室聚四氟乙烯膜分隔；所述聚四氟乙烯膜中间具有一个直径为100-150μM的通孔，所述通孔被磷脂双分子层充满，在所述磷脂双分子层中存在一个由α-溶血素七聚体蛋白形成的纳米孔；样品池系统中应用Ag/AgCl电极组成闭合回路。所述聚四氟乙烯膜的厚度为20μm。所述两个隔室(cis和trans)的体积均为1.5mL。所述样品池系统的构建方法具体如下：用玻璃毛细管将1体积份正十六烷和10体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测目标抗体的分子组合，包括探针分子和抗体捕获分子；所述探针分子是将瓜环修饰于单链DNA分子I的5’末端得到的；单链DNA分子I中，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区A；所述抗体捕获分子由单链DNA分子II和两个抗原分子组成；单链DNA分子II位于中间，单链DNA分子II的两个末端分别连接一个与目的抗体对应的抗原分子；DNA分子II中，5’端具有由n个核苷酸组成的结合区B，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区C；结合区B和结合区C为反向序列；结合区B与结合区A为反向互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测目标抗体的分子组合，包括探针分子和抗体捕获分子；所述探针分子是将瓜环修饰于单链DNA分子I的5’末端得到的；单链DNA分子I中，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区A；所述抗体捕获分子由单链DNA分子II和两个抗原分子组成；单链DNA分子II位于中间，单链DNA分子II的两个末端分别连接一个与目的抗体对应的抗原分子；DNA分子II中，5’端具有由n个核苷酸组成的结合区B，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区C；结合区B和结合区C为反向序列；结合区B与结合区A为反向互补序列。2.一种用于检测目标抗体的复合物，由探针分子和抗体捕获分子共孵育形成；所述探针分子是将瓜环修饰于单链DNA分子I的5’末端得到的；单链DNA分子I中，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区A；所述抗体捕获分子由单链DNA分子II和两个抗原分子组成；单链DNA分子II位于中间，单链DNA分子II的两个末端分别连接一个与目的抗体对应的抗原分子；DNA分子II中，5’端具有由n个核苷酸组成的结合区B，3’端具有由n个核苷酸组成的结合区C；结合区B和结合区C为反向序列；结合区B与结合区A为反向互补序列。3.如权利要求1所述的分子组合或权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述n为6-10之间的任意自然数；所述单链DNA分子I的长度为18-22bp；所述单链DNA分子II的长度为33-41bp。4.如权利要求1至3任一所述的分子组合，或，权利要求2或3所述的复合物，其特征在于：所述n为8；所述单链DNA分子I的长度为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海臣，刘蕾，郭秉元，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，中国科学院高能物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11