一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法及其试剂盒和应用技术

本发明专利技术公开了一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法，包括以下步骤：步骤一：染色质预清除；步骤二：对预清除后的染色质进行免疫共沉淀，然后加入转座体系进行转座反应；步骤三：用AMPure beads对已转座的DNA进行纯化；步骤四：文库扩增；步骤五：文库大小选择；其中，步骤二中还包括标签片段化方法。本发明专利技术的目的是提出一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法及其试剂盒和应用，通过对ChIP‑seq方法的改进，能有效对少细胞进行组蛋白修饰进行检测，其结果与大量细胞的检测的结果完全一致。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法及其试剂盒和应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法及其试剂盒和应用。
技术介绍
组蛋白是染色体基本结构--核小体中的重要组成部分，其多种氨基酸残基可发生乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitylation)等多种共价修饰作用。最新的研究表明，组蛋白氨基酸残基上还可以发生如巴豆酰化(crotonylation)、丙酰化(propionylation)、丁酰化(butyrylation)、2-羟基异丁基酰化(2-ohi-butyrylation)、琥珀酰化(succinylation)等全新的修饰类型，从而大大拓展了对组蛋白修饰的认识。组蛋白修饰可通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，从而改变染色质的疏松或凝集状态，或通过影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因调控作用。组蛋白修饰对基因表达的调控有类似DNA遗传密码的调控作用，是表观遗传学研究的核心内容之一。因此，组蛋白修饰又称为“组蛋白密码”或“表观遗传学密码”。染色质免疫共沉淀技术(chromatin-immunoprecipitation，ChIP)，因其能真实、完整地反映结合在DNA序列上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。基本原理与过程：通过在特定时间点上用甲醛交联等方式“固定”细胞内所有DNA结合蛋白的活动，相当于这一时间点上细胞内蛋白和DNA相互作用的关系被瞬时“快照(snapshot)”下来。再通过后续的裂解细胞、断裂DNA，将蛋白质-DNA复合物与特定DNA结合蛋白的抗体孵育，然后将与抗体特异结合的蛋白-DNA复合物洗脱下来，最后将洗脱得到的特异DNA与蛋白解离、纯化DNA后，进行建库测序。然而，常规的ChIP-seq方法需要大量的细胞(107细胞以上)，无法满足肿瘤干细胞等。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的是提出一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法及其试剂盒和应用，克服了现有染色质免疫共沉淀需要大量细胞的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法，包括以下步骤：步骤一：染色质预清除，以减少背景信号；步骤二：对预清除后的染色质进行免疫共沉淀，然后加入转座体系进行转座反应；步骤三：用AMPurebeads对已转座的DNA进行纯化，经典的ChIP通过商品化柱子(如QiagenMinElutekit)对IP的DNA进行过柱纯化，使DNA损失较多，会造成文库复杂度降低，而AMPurebeads回收可减少DNA的损失(约30％)；步骤四：文库扩增；步骤五：文库大小选择；其中，步骤二中还包括标签片段化方法，减少了建库过程的步骤，从而减少了材料的损耗。进一步的，所述标签片段化方法具体为在PCR仪中37℃孵育20分钟。进一步的，所述步骤三具体为向已转座的DNA中加入终浓度为0.65×的AMpurebeads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，将上清液转到新管中，加入终浓度为1.8×的AMpurebeads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液洗脱。进一步的，所述DNA与AMpurebeads的体积比为1∶2～3。一种采用上述的适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法的试剂盒。一种上述的适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法在少细胞组蛋白修饰检测中的应用。本专利技术的突出效果为：本专利技术的目的是提出一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法及其试剂盒和应用，通过对ChIP-seq方法的改进，能有效对少细胞进行组蛋白修饰进行检测，其结果与大量细胞的检测的结果完全一致，与现有技术相比，本专利技术能减少细胞量达100倍，使得我们对一些临床活检组织和稀有细胞的检测成为可能；该方法对于未来临床标本库组织的组蛋白修饰检测，并结合患者的临床数据，从而建立基于组蛋白修饰与患者预后的模型，对临床活检样本或肿瘤干细胞等稀有细胞的检测，绘制患者的表观基因组图谱，对于促进精准医疗的发展，具有重要的意义。附图说明图1为本专利技术实施例的H3K4me1，H3K27Ac检测示例截图之一(Ahdc基因)；图2为本专利技术实施例的H3K4me1，H3K27Ac检测示例截图之二(Ncor2基因)；图3为本专利技术实施例的H3K4me1，H3K27Ac检测示例截图之三(Rxra基因)；图4为本专利技术实施例的Pearson相关系数分析图；图5为本专利技术实施例protocol与常规protocol对少细胞量小鼠肝脏细胞进行H3K27AcChIP-seq的对比图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例C57BL6小鼠心肌细胞H3K4me1,H3K27AcChIP-seq实验A.ab-proteinG包被1.取20μlProteinGbeads，转移到1.5mLEppendorf管中；2.放到磁架上，静置2min，然后移除上清；3.用1mL0.1％TritonX-100/1XPBS清洗2次；4.加入200μl0.1％TritonX-100/1XPBS和抗体(按下表)；组蛋白修饰货号浓度每个ChIP反应H3K4me3A5051-001P1μg/μl1μgH3K36me3A1847-001P1.19μg/μl0.5μgH3K27acA1723-00402.84μg/μl1μgH3K4me1A1863-001P0.93μg/μl0.5μgH3K27me3A1811-001P1.91μg/μl1μgH3K9me3A1671-001P2.69μg/μl1μg1.4℃旋转孵育过夜。B.染色质预清除1.对1×105小鼠心肌细胞进行超声破碎(Bioruptor)，使得片段大小为150-300bp；2.取20μlProteinGbeads，转移到1.5mLEppendorf管中；3.放到磁架上，静置2min，然后移除上清；4.用1mL0.1％TritonX-100/1XPBS清洗2次后去上清；5.把超声破碎过的染色质加入到ProteinGbeads中4℃旋转孵育1hr后放到磁架上，转移上清(预清除后的染色质)到一个新的管子中。C.免疫共沉淀及转座1.把A中最后一步的上清去掉，然后把预清除后的染色质与ab-proteinG4℃旋转孵育过夜；2.用下列buffer进行对进行清洗，(500μl，4℃旋转5min)：ChIPwash11xChIPwash22xChIPwash32x；3.最后一轮清洗后，转移样品到一个新的管子中，去除washbuffer；4.1:1稀释TagmentDNAbuffer；5.重悬磁珠在24μl已稀释过的TagmentDNAbuffer中，加入1μlTagmentDNAEnzyme(NexteraDNASamplePrepKit(Illumina))；6.37℃孵育20minutes(PCR仪上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：染色质预清除；步骤二：对预清除后的染色质进行免疫共沉淀，然后加入转座体系进行转座反应；步骤三：用AMPure beads对已转座的DNA进行纯化；步骤四：文库扩增；步骤五：文库大小选择；其中，步骤二中还包括标签片段化方法。

【技术特征摘要】
1.一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：染色质预清除；步骤二：对预清除后的染色质进行免疫共沉淀，然后加入转座体系进行转座反应；步骤三：用AMPurebeads对已转座的DNA进行纯化；步骤四：文库扩增；步骤五：文库大小选择；其中，步骤二中还包括标签片段化方法。2.根据权利要求1所述的一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法，其特征在于：所述标签片段化方法具体为在PCR仪中37℃孵育20分钟。3.根据权利要求1所述的一种适用于少细胞的染色质免疫共沉淀测序方法，其特征在于：所述步骤三具体为向已转座的DNA中加入终浓度为0.65×的AMpu...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯宇亮，姜昊，陈海洋，郑晓斌，
申请(专利权)人：苏州睿迈英基因检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32