一种检测细胞培养中支原体感染的新方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种检测细胞培养中支原体感染的新方法，取细胞培养液的上清液作为样本；以提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应，得到PCR反应产物；以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳检测图；接着进行ELISA反应；确定样品浓度。本发明专利技术保证了实验的可靠性和稳定性，比单独设置阳性对照。将PCR技术与ELISA技术相结合，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。 1

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞培养中支原体感染的新方法
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种检测细胞培养中支原体感染的新方法。
技术介绍
支原体(Mycoplasma)是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，是目前所知能在无生命培养基中生长繁殖的最小的微生物。支原体感染造成的危害非常广泛，可引起人、动物、植物和昆虫等多种疾病，已受到人们的广泛重视。但基于支原体具有菌体形态小、多样、生长缓慢及支原体种属间交叉抗原的存在等生物学特性，限制了支原体检测的一些简单直观的方法。在PCR法检测支原体中，因为PCR技术本身的缺陷，也存在一些问题，如：易发生污染、易发生交叉反应、产生假阳性假阴性结果等。一般的支原体污染的PCR检测方法中多以去核酸水为阴性对照模板，阳性对照模板为支原体基因组DNA，以此来判定检测结果。这样检测中要单独设置阳性对照，不仅浪费试剂，而且PCR过程和电泳检测过程都会更加繁琐。同时还要单独制备支原体基因组DNA，更加增加了检测的繁琐程度；最重要的问题是检测体系与阳性对照体系分处于不同的PCR体系，即使阳性对照正常，也有可能出现错判的情况。综上，现有技术存在的问题是：现有支原体检测方法易发生污染、易发生交叉反应、产生假阳性假阴性结果等；浪费试剂，PCR过程和电泳检测过程都会更加繁琐，有可能出现错判的情况。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测细胞培养中支原体感染的新方法。本专利技术是这样实现的，一种检测细胞培养中支原体感染的新方法进一步，包括以下步骤：步骤一，取培养时间为3-7天的细胞培养液的上清液作为样本；步骤二，提取待检细胞的DNA；步骤三，以提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应，得到PCR反应产物；步骤四，以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；步骤五，观察琼脂糖凝胶电泳检测图；步骤六，ELISA反应；对反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；步骤七，确定样品浓度；根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照关系曲线，根据PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据PCR反应产物的浓度，计算得到待测样品的浓度。进一步，所述琼脂糖凝胶电泳检测图，判定检测结果的方法如下：1)当特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物出现，阴性对照没有出现扩增产物时，说明PCR体系正常工作，此时的PCR检测结果准确可靠；1.1)此时，如果没有出现特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中没有出现支原体感染；1.2)此时，如果出现了特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中出现了支原体感染；2)如果特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物没有出现，说明PCR体系没有正常工作，此时检测结果无效；3)如果阴性对照出现扩增产物，说明PCR体系受到感染，此时检测结果无效。本专利技术的优点及积极效果为：以PCR方法检测培养细胞是否被支原体感染时，要提取培养的细胞的DNA作为PCR体系中的反应模板，而模板中有大量的细胞基因组DNA，在检测PCR体系中加入特异性扩增细胞基因组中管家基因细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)DNA序列的引物对，即可以当成检测PCR反应体系是否正常工作的阳性对照，就可以省去单独设置阳性对照的步骤，而且阳性对照和检测在同一PCR体系中进行，进而保证了实验的可靠性和稳定性，比单独设置阳性对照，其结果更加可靠、直观。将PCR技术与ELISA技术相结合，是一种半定量核酸检测技术，既有PCR技术快速、灵敏的特点，又在特异性鉴定以及量化方面超越了PCR法，使实验结果特异性增强、灵敏度提高、客观度上更可信，避免了PCR法极易出现假阳性和假阴性结果的弊端。附图说明图1是本专利技术实施提供的检测细胞培养中支原体感染的新方法流程图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作进一步描述。如图1所示，本专利技术提供一种检测细胞培养中支原体感染的新方法包括以下步骤：S101，取培养时间为3-7天的细胞培养液的上清液作为样本；S102，提取待检细胞的DNA；S103，以提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应，得到PCR反应产物；S104，以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；S105，观察琼脂糖凝胶电泳检测图；S106，ELISA反应；对上述反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；S107，确定样品浓度；根据不同浓度的标准品的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照关系曲线，根据PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据PCR反应产物的浓度，计算得到待测样品的浓度。本专利技术提供步骤S105中琼脂糖凝胶电泳检测图，判定检测结果的方法如下：1)当特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物出现，阴性对照没有出现扩增产物时，说明PCR体系正常工作，此时的PCR检测结果准确可靠；1.1)此时，如果没有出现特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中没有出现支原体感染；1.2)此时，如果出现了特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中出现了支原体感染；2)如果特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物没有出现，说明PCR体系没有正常工作，此时检测结果无效；3)如果阴性对照出现扩增产物，说明PCR体系受到感染，此时检测结果无效。以上仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞培养中支原体感染的新方法，其特征在于，所述检测细胞培养中支原

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞培养中支原体感染的新方法，其特征在于，所述检测细胞培养中支原体感染的新方法采用细胞悬液和点杂交，将基因组样品点在硝酸纤维素薄膜上，上一抗和二抗，一抗是抗m6A抗体，二抗是抗抗m6A抗体的抗体，二抗有显色效果，根据显色的差异，判断是否有支原体感染；如果信号特别高，有支原体感染。2.如权利要求1的检测细胞培养中支原体感染的新方法，其特征在于，所述检测细胞培养中支原体感染的新方法包括以下步骤：步骤一，取培养时间为3-7天的细胞培养液的上清液作为样本；步骤二，提取待检细胞的DNA；步骤三，以提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应，得到PCR反应产物；步骤四，以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；步骤五，观察琼脂糖凝胶电泳检测图；步骤六，ELISA反应；对反应产物和不同浓度的标准品分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量PCR反应产物和不同浓度标准品的OD450值；步骤七，确定样品浓度；根据不同浓度的标准品的OD450值，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋晓春，黄守均，凌梅，贺伟，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34