微量细胞ChIP法制造技术

本发明专利技术涉及一种微量细胞ChIP法。所述方法包括：1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；2).将第n组样品交联固定；3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；4).使用Tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段DNA的两端；当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；5).当n≥2时，将各组样品合并；6).富集与靶蛋白结合的DNA片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。该方法测序时建库效率高，且能实现对极微量细胞的转录因子位点捕捉，并保证较好效率，稳定性和精确度都较好。

Microcell ChIP method

The present invention relates to a microcell ChIP method. The methods described included: 1). The samples were divided into N group, N was non 0 natural number; 2). Group n samples were crosslinked and fixed; 3) the samples of group n were treated with cell membrane punching agent; 4). The chromatin fragment of group N was cut off using Tn5 transpase enzyme enzyme, and barcode sequence and primer sequence were connected to DNA of product fragment. Both ends; barcode sequence and / or primer sequence used in each group when n > 2, step 4, and / or primer sequences are different; 5). When n is more than 2, each sample is merged; 6) is enriched with the target protein DNA fragment, and the primers are used as index library and sequencing analysis. The method has high efficiency and can capture transcription factor loci of extremely microcells, and ensures good efficiency, stability and accuracy.

【技术实现步骤摘要】
微量细胞ChIP法
本专利技术涉及分子生物学实验
，具体而言，涉及一种微量细胞ChIP法。
技术介绍
生物的基因调控和表达是极其复杂但有序的过程，生物体基因组DNA在细胞中以染色质形式存在，蛋白质和DNA互作是细胞行使功能的重要基础。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用可以进一步了解基因表达及其调控模式。染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是研究DNA-蛋白质在体内相互作用的标准方法。染色质免疫共沉淀技术可以定位分析体内蛋白质与DNA的作用位点，运用ChIP技术与其他方法相结合，例如与高密度芯片(microarray)、测序(sequencing)、体内足迹法等技术相结合可以获得整个基因组水平的单一转录因子分布图谱、反式因子体内结合位点，以及系统揭示核小体定位、组蛋白修饰等表观遗传的遗传机制。ChIP技术的一般技术流程为：首先对细胞或组织进行不同时间的甲醛交联，分别裂解细胞膜及细胞核，使用超声方式将染色质打碎成一定长度范围的片段。加入抗体，抗体会特异性地与靶蛋白结合，而后通过磁珠与抗体的相互作用，将靶蛋白及与其结合的DNA片段富集。解交联并消化蛋白后，对捕获的DNA片段建库，进行第二代测序。根据数据片段在基因组上的富集情况，进而获得全基因组水平的特定蛋白与DNA相互作用的图谱。然而，现有的ChIP-seq技术主要存在如下问题：1.建库效率低，不适用于少量细胞实验利用适当的超声条件获得片段大小合适的DNA-染色质复合物是整个染色质免疫共沉淀实验成功的前提，然而使用超声法打断的ChIP-seq技术对细胞数量有一定的要求，适用于几万至百万数量级的细胞处理。主要原因是传统Illumina的TruSeq建库策略中的adaptor与DNA片段连接效率较低，而使得很多片段在后面的扩增集中没有被富集而丢失。尤其当研究的问题需要针对少量细胞群体的时候，严重的信息丢失使得实验者无法获得较为准确的真实信息。2.超声法打断染色质片段方法不利于与DNA间接结合的转录因子的研究全基因组范围内，有很多转录因子不是与基因组DNA直接结合的，而是与其他转录因子结合后，间接地结合在基因组DNA上。即使是甲醛交联过的样品，这种间接结合也比较容易被破坏。超声过程具有一定程度的物理破碎强度，容易干扰这些间接结合靶蛋白与DNA结合的稳定性，而造成后续信息的丢失。3.文库非特异性背景较高，检测分辨率低超声打断法是对染色质进行随机打断，获得一定长度范围内的片段。因此，在靶蛋白及DNA复合物的周围也带有一些非靶蛋白特异结合的DNA序列或是其他蛋白结合的位点。这些非特异性位点在后面建库测序过程中均会被保存下来，成为靶蛋白图谱分析的干扰背景，获得宽峰，降低了检测结合位点的分辨率和准确性。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术涉及一种微量细胞ChIP法，包括：1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；2).将第n组样品交联固定；3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；4).使用Tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段DNA的两端；当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；5).当n≥2时，将各组样品合并；6).富集与靶蛋白结合的DNA片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是研究DNA-蛋白质在体内相互作用的标准方法，而在二者有相互作用时，DNA通常会从组蛋白上解开，并非以核小体的形式存在。Tn5转座酶在酶切染色质片段时，不会酶切核小体形式的DNA片段，因而与现有技术的超声打断法相比具有更好的特异性。barcode序列实质为一段核酸序列，其相当于给被切割下来的DNA片段加上不同的标签序列，因而当不同组(n≥2)的样品进行后续测序操作时，可将各组通过其各自特异的barcode序列进行区分。在极限情形下，当每组样品中的细胞数位1个时，本专利技术所提供的方法能够实现单细胞ChIP。基于Tn5转座酶(transposase)的barcode复杂度(即能有多少独一无二的barcode)还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别(如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode)，barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。本专利技术采用组合索引(combinatorialindexing)的方法。标签的设定方式为barcode序列+引物序列，从而增加整体的复杂度，增加了一次能够捕获的单细胞数目。当样品不需要进行区分时(n＝1)，引物序列采用通用引物即可，后续建库操作更加方便；当需要区分不同的样品时(n≥2)，则各组的引物序列和/或barcode序列不同，从而能使得各样品得到有效区分。优选的，对单细胞进行操作的方法可采用为本领域技术人员所公知的方法进行，例如将单细胞悬液样品和带有barcode和/或引物序列的Tn5酶的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞被Tn5酶所切割的DNA片段，就都会带上了独一无二的标签。最后，我们再将所有单细胞的DNA片段混在一起，以所述引物序列建库测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)建库效率高，对微量细胞乃至单细胞的组蛋白信息捕获量显著提高；在Tn5酶切时候，将含有barcode序列的引物连接在了产物片段DNA的两端，这一高效的引物连接过程使得含有barcode序列的扩增引物连接在目标DNA片段两端的效率大大提高，从而在后面扩增过程中捕获了更多的信息量。目前已经在微量细胞(100个)乃至单细胞水平实现了组蛋白结合位点的测序及数据分析，与用传统方法处理大量细胞获得的信息量具有较高的准确性和精确性，并明显降低了非特异性背景(如图2)。尤其单细胞水平的数据，和之前仅有的一篇单细胞ChIP数据(AssafRotem,2015,NatureBiotechnology)相比，有了数量级的提高。那篇文章测得数据中，每个细胞平均获得uniquededuplicatesreads800个左右，而利用本专利技术所提供的技术方案，每个细胞平均获得uniquededuplicatesreads5000个左右。(2)实现对极微量细胞的转录因子位点捕捉，并保证较好效率；目前也实现了微量细胞(100个)的转录因子的全基因组位点检测，捕获信号理想，与大量细胞获得的数据相比，具有一定的精确性和准确性。(3)降低非特异性背景；在测序结果可视化界面中，可以显著地看到新技术的非特异性背景相比于传统超声方式ChIP数据的背景有所降低，而且检测富集峰更特异、更显著。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一种实施方案，对于本领域普通技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微量细胞ChIP法，其特征在于，包括：1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；2).将第n组样品交联固定；3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；4).使用Tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段DNA的两端；当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；5).当n≥2时，将各组样品合并；6).富集与靶蛋白结合的DNA片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。

【技术特征摘要】
1.一种微量细胞ChIP法，其特征在于，包括：1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；2).将第n组样品交联固定；3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；4).使用Tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段DNA的两端；当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；5).当n≥2时，将各组样品合并；6).富集与靶蛋白结合的DNA片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。2.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，所述第n组样品的细胞数目≥1；优选的，1≤所述第n组样品的细胞数目≤1000000；优选的，1≤所述第n组样品的细胞数目≤1000。3.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，在步骤1)之后、步骤2)之前还包括：使用含有SDS的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质；优选的，所述含有SDS的溶液中SDS的浓度为0.1w/v％～1.0w/v％。4.根据权利要求3所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，所述使用含有SDS的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质的步骤具体包括：将所述细胞样品使用含有SDS的溶液于10℃～37℃下处理5min～60min。5.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，在步骤2)中，所述细胞膜打孔剂具体为含有TritonX-100的溶液；优选的，所述含有TritonX-100的溶液中TritonX-100的浓度为0.5v/v％～2v/v％；更优选的，所述使用细胞膜打孔剂处理细胞的处理条件为：10℃～37℃孵育5min～60min。6.根据权利要求1所述的微...

【专利技术属性】
技术研发人员：何爱彬，李晨，艾珊珊，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11