用于生成邻近探针的方法技术

本发明专利技术提供了多对邻近探针以及其生产方法，每对能够结合至不同的靶标分析物，其中每对探针的第一和第二邻近探针包括缀合至其分析物结合部分的通用寡核苷酸，并且与通用寡核苷酸杂交的是不同的标签寡核苷酸，其包括对所有标签寡核苷酸共同的通用补体结构域和对每个标签寡核苷酸唯一的单一结构域。

A method for generating adjacent probes

The present invention provides a plurality of adjacent probes and their production methods, each pair of which can be combined to different target analytes, in which the first and second adjacent probes for each pair of probes include the common oligonucleotides conjugated to their analyte binding parts, and are different label oligonucleotides with the general oligonucleotides, which include For all tagged oligonucleotides, the common complement domain and the unique single domain for each tagged oligonucleotide are common.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生成邻近探针的方法本专利技术涉及制造探针(邻近探针)的方法，该探针用于样品中的分析物的基于邻近探针(proximityprobe)的检测试验。具体而言，本专利技术涉及用于生产具有不同靶标分析物结合特异性并且包括不同核酸结构域的多种邻近探针对的改进的方法。邻近探针通常配对使用，例如第一和第二邻近探针，并且配对的每个邻近探针通常包括对靶标分析物具有特异性的分析物-结合结构域，和功能结构域，例如偶联至其的核酸结构域。然而，存在其中可以组合使用多于两种例如三种邻近探针的邻近试验(proximityassay)版本。分析物-结合结构域可以是例如核酸“适配体”(Fredrikssonetal(2002)NatBiotech20:473-477)或可以是蛋白质的，比如单克隆或多克隆抗体(Gullbergetal(2004)ProcNatlAcadSciUSA101:8420-8424)。每个邻近探针对的各自的分析物-结合结构域可以针对分析物上不同的结合位点具有特异性，该分析物可以由单个分子或相互作用分子的复合物构成，或可以具有相同的特异性，例如在靶标分析物作为多聚体存在的情况下。邻近试验依赖于“邻近探测”的原理，其中通过多种(即，两种或更多种，通常两种或三种)探针的结合检测分析物，当该探针通过结合至分析物而邻近时(因此是“邻近探针”)，使得生成信号。邻近试验中信号的生成涉及核酸结构域和/或被添加至样品或由其它探针(一种或多种)携带的进一步的功能部分之间的相互作用。当邻近探针对(或组)变得彼此紧密邻近时，这主要当两种(或所有)都被结合至相同分析物分子、或复合物中不同分析物分子上的其各自的位点时发生，功能结构域(例如核酸结构域)能够直接地或间接地相互作用，以生成可检测的信号(即在样品中先前不存在的核酸序列)，其可以被检测以指示样品中靶标抗原的存在。因而信号生成取决于探针(更具体地通过由它们携带的核酸或其它功能部分/结构域)之间的相互作用，并且通常需要形成一种或多种核酸双链体，例如通过核酸结构域的直接或间接相互作用，其使得能够进行连接反应(核酸结构域彼此的连接反应，或其中核酸结构域(一个或多个)模板化(template)一个或多个单独添加的寡核苷酸的连接)和/或延伸反应(例如核酸结构域中的至少一种的延伸反应)，从而生成可检测的信号。信号因此仅当两个(或所有)必需探针都已经结合至分析物时出现，从而将改进的特异性赋予检测系统。近年来已经发展了邻近探测的概念，并且现在许多基于此原理的试验是本领域熟知的，例如基于邻近探针的检测试验包括邻近延伸试验(PEA)、邻近连接试验(PLA)(US6878515、WO01/61037)、原位PLA(WO9949079)(其是用于以局部方式原位检测细胞或组织样品中的分子的PLA，其中环状核酸分子由连接一个或多个(通常2个)添加的寡核苷酸——该连接由一个或多个核酸结构域模板化——形成，其中环状分子通过滚环扩增——其由核酸结构域启动——被扩增，从而以将扩增产物定位至邻近探针并且因此定位至分析物)，和邻近HCRPCT/EP2015/052340。制造用于基于邻近的检测试验的探针需要缀合(即偶联或连接)核酸结构域(或部分)至分析物结合结构域。核酸结构域(即功能结构域，其与样品中的另一个核酸结构域或核酸分子相互作用以产生可检测的信号)通常被缀合(例如通过共价键)至分析物结合结构域以形成邻近探针。然而，由于核酸结构域(功能结构域)通常被直接附加至其各自的分析物结合结构域，包括特定核酸和分析物结合结构域的每个邻近探针的制造通常需要活化核酸分子和其随后缀合至其各自的分析物结合结构域。因而，无论何时需要新的邻近探针，新的寡核苷酸分子将被活化并且缀合至需要的分析物结合结构域。这增加与生成用于基于邻近的检测试验的新试剂相关联的时间和成本，并且是遏制高通量(例如多重)邻近检测试验的扩展的重大因素。另外，已知活化寡核苷酸的效率(并且因而将核酸结构域缀合至其分析物结合结构域的效率)变化。由于每次制造探针时，寡核苷酸被独立地活化并且缀合至其各自的分析物结合结构域，难以确保不同的邻近探针(例如缀合至不同核酸结构域的分析物结合结构域)包括类似水平的寡核苷酸。邻近检测试验中不同靶标分析物的检测效率将因而是可变的，其妨碍样品中不同水平的分析物之间的任何比较。出于类似的原因，还难以在经由此方法生产的单独批次的探针之间取得一致性，因而影响邻近检测试验的再现性和限制可以进行的研究规模。当前的制造方法还不能提供直接方式以改变基于指定给检测试验的特异性的序列(即以改变被缀合至用于检测试验的特定邻近探针的分析物结合结构域的核酸结构域)，例如使得探针(或探针对)可以以不同的邻近检测格式使用，或连同不同的检测试剂使用，或以便制作不同的探针组合。目前，生成新的邻近探针，即分析物结合结构域和不同的核酸结构域，需要活化和缀合具有新序列的新的寡核苷酸分子至分析物结合结构域。如上面记载的，这增加与生成用于基于邻近的检测试验的新试剂相关联的时间和成本。本专利技术试图克服制造用于基于邻近的检测试验的探针中的上述限制，并且因而提供了用于制造邻近探针的改进的方法。更具体地，本专利技术提供了用于制造邻近探针对——其可以被用于基于邻近的检测试验——的改进的方法。最宽泛地，本专利技术提供了制造邻近探针对的方法，所述对包括第一和第二邻近探针，其中每个邻近探针包括分析物结合结构域和部分双链核酸结构域并且对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，邻近探针对的核酸结构域能够直接地或间接地相互作用，所述方法包括：a.将第一通用寡核苷酸缀合至第一分析物结合部分以形成第一通用缀合物；b.将第二通用寡核苷酸缀合至第二分析物结合部分以形成第二通用缀合物；c.使第一标签寡核苷酸——其包括与第一通用寡核苷酸互补的第一通用补体结构域和不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交的第一单一结构域——与第一通用缀合物的第一通用寡核苷酸杂交，从而以形成第一邻近探针；d.使第二关联(cognate)标签寡核苷酸——其包括与第二通用寡核苷酸互补的第二通用补体结构域和不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交的第二单一结构域——与第二通用缀合物的第二通用寡核苷酸杂交，从而以形成第二邻近探针；其中所述第一和第二单一结构域能够介导彼此相互作用——直接地或间接地，从而使得第一和第二邻近探针的核酸结构域能够相互作用；e.选择第一和第二邻近探针，从而提供邻近探针对。选择步骤(e)是将探针对匹配在一起以制作(或提供)邻近探针组合的步骤。可选地表达的，步骤(e)可以是将第一邻近探针与关联的第二邻近探针配对的步骤。如下面进一步讨论的，关联的邻近探针包括能够彼此相互作用的核酸结构域。步骤(e)因而可以被视为组合第一和第二邻近探针以制作或获得邻近探针对的步骤。然而，在这方面将理解组合可以在理论上完成，并且未必需要或涉及物理组合邻近探针的两个成员(例如以进行第一和第二邻近探针的物理混合物)。当进行使用探针的邻近试验时，第一和第二邻近探针在使用中可以被组合(例如作为物理混合物)。在另一个实施方式中，第一和第二邻近探针的组合对可以被一起用于邻近试验，而未必以物理掺合物被提供或使用。换句话说，它们都可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造多对邻近探针的方法，其中每对邻近探针包括第一和第二邻近探针并且每对能够结合至不同的靶标分析物，其中每个邻近探针包括分析物结合结构域和部分双链核酸结构域并且配对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，所述邻近探针对的所述核酸结构域能够直接或间接相互作用，所述方法包括：a.将第一通用寡核苷酸缀合至多个第一分析物结合部分中的每个，以形成第一通用缀合物组；b.将第二通用寡核苷酸缀合至多个第二分析物结合部分中的每个，以形成第二通用缀合物组；c.使多个不同的第一标签寡核苷酸中的一个与第一通用缀合物组中的每个第一通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第一邻近探针，每个不同的第一标签寡核苷酸包括第一通用补体结构域，其对所有第一标签寡核苷酸是共同的并且其与第一通用寡核苷酸互补；和第一单一结构域，其对每个不同的第一标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；d.使多个不同的第二关联标签寡核苷酸中的一个与第二通用缀合物组中的每个第二通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第二邻近探针，每个不同的第二标签寡核苷酸包括第二通用补体结构域，其对所有第二标签寡核苷酸是共同的并且其与第二通用寡核苷酸互补；和第二单一结构域，其对每个不同的第二标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；e.从所述多种第一邻近探针选择多个第一邻近探针并且从所述多种第二邻近探针选择多个关联的第二邻近探针，从而提供多对邻近探针。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.21 GB 1518655.41.一种制造多对邻近探针的方法，其中每对邻近探针包括第一和第二邻近探针并且每对能够结合至不同的靶标分析物，其中每个邻近探针包括分析物结合结构域和部分双链核酸结构域并且配对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，所述邻近探针对的所述核酸结构域能够直接或间接相互作用，所述方法包括：a.将第一通用寡核苷酸缀合至多个第一分析物结合部分中的每个，以形成第一通用缀合物组；b.将第二通用寡核苷酸缀合至多个第二分析物结合部分中的每个，以形成第二通用缀合物组；c.使多个不同的第一标签寡核苷酸中的一个与第一通用缀合物组中的每个第一通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第一邻近探针，每个不同的第一标签寡核苷酸包括第一通用补体结构域，其对所有第一标签寡核苷酸是共同的并且其与第一通用寡核苷酸互补；和第一单一结构域，其对每个不同的第一标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；d.使多个不同的第二关联标签寡核苷酸中的一个与第二通用缀合物组中的每个第二通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第二邻近探针，每个不同的第二标签寡核苷酸包括第二通用补体结构域，其对所有第二标签寡核苷酸是共同的并且其与第二通用寡核苷酸互补；和第二单一结构域，其对每个不同的第二标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；e.从所述多种第一邻近探针选择多个第一邻近探针并且从所述多种第二邻近探针选择多个关联的第二邻近探针，从而提供多对邻近探针。2.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二通用寡核苷酸是不同的。3.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二通用寡核苷酸是相同的。4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一和第二标签寡核苷酸能够通过杂交相互作用。5.权利要求4所述的方法，其中所述第一和第二标签寡核苷酸包括游离的3’末端。6.权利要求5所述的方法，其中所述第一和第二标签寡核苷酸在其3’末端处包括互补区。7.权利要求4至6中任一项所述的方法，其中可以使用关联的标签寡核苷酸作为延伸模板延伸所述第一和/或第二标签寡核苷酸。8.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一标签寡核苷酸包括游离的3’末端，并且其中所述第二标签寡核苷酸包括游离的5’末端，其中所述第一和第二标签寡核苷酸通过其各自的游离端与共同的夹板寡核苷酸杂交。9.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一和第二标签寡核苷酸模板化可环化寡核苷酸分子或寡核苷酸分子对的环化。10.权利要求9所述的方法，其中所述第一标签寡核苷酸包括与第一个添加的寡核苷酸分子的5’和3’末端的互补区，并且其中所述第二标签寡核苷酸包括与所述第一个可环化寡核苷酸的所述5’和3’末端之间的区或与第二个添加的寡核苷酸的互补区。11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中每个第一邻近探针的标签寡核苷酸可以仅与其关联的第二邻近探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·E·西蒙·弗雷德里克松，克拉斯·M·伦德伯格，
申请(专利权)人：欧凌科蛋白质公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE