检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，所述融血试剂中含有表面活性剂；所述微球试剂包括直径不同的N种微球，所述N种微球上分别对应偶联N种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，N的取值范围为2～10的正整数；所述荧光试剂包括所述N种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。

【技术实现步骤摘要】
检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒
本专利技术属于分子生物技术技术，尤其涉及一种联合检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒。
技术介绍
免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体(或抗原)检测组织、细胞或血清中的相应抗原(或抗体)的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。目前常用的免疫荧光技术包括：放射免疫，酶联免疫，乳胶比浊，干式荧光免疫，时间分辨荧光免疫，化学发光免疫等等。化学发光免疫是目前最主流的免疫检测方法，检测原理通常为：将磁性微球作为固相材料偶联单克隆抗体(一抗)，与抗原反应后，加入酶标记的单克隆抗体(二抗)，充分反应后经洗涤、分离和纯化去除未反应的试剂。然后加入发光底物(发光显色剂)，在适当的孵育条件下，底物被酶催化显色。最后根据反应液整体发光强度判断抗原浓度，对单个项目进行定量测定。该方法检测速度快、灵敏度高，广泛应用在检验科中心实验室。但一方面，由于检测阶段须测定反应液的整体发光值，因此在抗原抗体反应阶段，需要加入过量的二抗试剂，来获得充分反应，进而在孵育之后要进行多步骤的洗涤和磁分离，来去除过量未反应的二抗试剂。这使得整个仪器结构复杂，成本变高，体机变大，检测速度变慢。另一方面，化学发光免疫仅能够使用血清作为测定样本，临床收集全血后还要进行血液分层和血清抽提，增加了临床使用的复杂程度和污染风险，无法在门急诊和基层医疗机构广泛开展。此外，采用化学发光免疫技术每次检测只能测定一个项目，无法实现多个项目的同时检测。干式荧光免疫由于其操作方便，广泛应用。干式荧光免疫技术的方法通常为：全血或血清样本经过滤网后进入样品垫，样本中如有待测抗原，待测抗原首先在结合垫下与荧光素标记的单克隆抗体(一抗)结合，形成抗原-抗体*荧光素复合物，并靠毛细作用向测试线移动。测试线上固定有另一单克隆抗体(二抗)，当反应液层析至测试线时，可以进一步形成标记有荧光素的双抗夹心复合物，用相应波长的激光照射检测线上聚积的反应物产生荧光，从而进行定量测定。但采用干式荧光免疫检测时，由于固相液相反应本身存在更大的不确定性，而且反应物在测试线位置的堆积是有厚度的，而激光仅能把测试线表面的荧光素激发，因此干式荧光试条的批内精密度CV通常超过10％(CV＝同一个样本20次测定的标准差/平均值*100％)，即精密度不足，这限制了干式荧光免疫技术的应用。此外，干式试条每个测试都要有固相载体、NC膜、干式反应需要大量的抗体，因此试剂成本远高于液相的试剂(如化学发光免疫、悬浮阵列免疫等)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种联合检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒，旨在解决现有的炎症标志物的免疫检测方法，只能针对血清样本进行检测，而且检测时间长、操作复杂、价格高，且每个测试只能测定一个项目的问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，所述融血试剂中含有表面活性剂；所述微球试剂包括直径不同的N种微球，所述N种微球上分别对应偶联N种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，N的取值范围为2～10的正整数；所述荧光试剂包括所述N种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。以及，一种联合检测多种炎症生物标志物的方法，至少包括以下步骤：提供全血样本、血清样本和如上述联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒；在所述血清样本中加入与所述N种炎症生物标志物对应的N种商业抗原，配置成梯度浓度的工作标准溶液，获取N种炎症生物标志物的浓度-荧光强度标准曲线；在所述全血样本中加入融血试剂，进行融血孵育处理，得到融血样本；在所述融血样本中加入微球试剂和荧光试剂，经免疫反应获得待测样本；在与所述工作标准品相同的检测条件下，采用悬浮阵列荧光免疫分析仪对所述待测样本进行检测，将检测结果与所述浓度-荧光标准曲线进行比对，获得N种炎症生物标志物的浓度。本专利技术提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，以微球体积作为编码，在多个不同直径的的微球上分别偶联标记有生物素的N种炎症生物标志物的单克隆抗体(一抗)，当样本中有这些待测炎症生物标志物时，不同直径的微球分别捕捉不同的待测物，在加入标记有荧光素的N种炎症生物标志物的第二单克隆抗体后，微球上分别形成针对不同炎症生物标志物的双抗夹心反应物。采用悬浮阵列荧光免疫分析仪定量测定，通过对每种体积的微球逐个分析并累加计算结果，最终同时获得N种炎症生物标志物的定量测定结果。具体的，本专利技术提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒具有以下优点：首先，可通过悬浮阵列荧光免疫分析仪实现N种炎症生物标志物的联合检测，且具有成本低、效率高、精密度高的优点。其次，本专利技术提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，可使用全血作为样本，反应过程在液相环境进行，无需多步的洗涤分离纯化，可以在不进行血清分离的前提下快速、方便、准确的进行炎症标志物的联合检测，填补了市场空白。再次，本专利技术提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，试剂制备核心原材料用量少，能够大幅降低检测成本。本专利技术提供的联合检测多种炎症生物标志物的方法，基于联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒的工作原理，具有以下优点：第一，本专利技术可以以全血为样本检测，操作方便、检测快速，且能够一站式完成多个炎症标志物项目的检测，使炎症生物标志物的检测水准提高了一个台阶。第二，在检测阶段针对每个微球进行定量测定，之后将结果累加，因此不需要对微球进行洗涤和分离步骤，具有设备成本更低、体机更小的优点。以同时实现三个炎症生物标志物的检测为例，悬浮阵列免疫技术使用的微球和抗体数量大概是现有化学发光技术的一半、干式荧光免疫技术的十分之一，此外，还能大幅降低外包材的包装成本，因此，本专利技术具有明显的成本优势。第三，本专利技术基于悬浮阵列免疫技术采用双抗夹心的液相反应，精密度达到现有免疫测试的最高水平，CV<5％。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。在本专利技术的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本专利技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。本专利技术实施例提供了一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，所述融血试剂中含有表面活性剂；所述微球试剂包括直径不同的N种微球，所述N种微球上分别对应偶联N种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，N的取值范围为2～10的正整数；所述荧光试剂包括所述N种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。本专利技术实施例提供的联合检测多种炎症生物标志本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，所述融血试剂中含有表面活性剂；所述微球试剂包括直径不同的N种微球，所述N种微球上分别对应偶联N种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，N的取值范围为2～10的正整数；所述荧光试剂包括所述N种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。

【技术特征摘要】
1.一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，所述融血试剂中含有表面活性剂；所述微球试剂包括直径不同的N种微球，所述N种微球上分别对应偶联N种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，N的取值范围为2～10的正整数；所述荧光试剂包括所述N种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。2.如权利要求1所述的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述微球选自链霉素、羟基或氨基修饰的高分子微球，链霉素、羟基或氨基修饰的金属微球中的一种。3.如权利要求1所述的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述N的取值范围为2～5的正整数，且所述炎症生物标志物选自C反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白A、白介素、脂蛋白相关磷脂酶A2。4.如权利要求1-3任一项所述的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述融血试剂包括融血试剂浓缩液和融血试剂稀释液，且所述融血试剂浓缩液和所述融血试剂稀释液的体积比为(1:20)～(1:5)。5.如权利要求4所述的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，以所述融血试剂浓缩液的总重量为100％计，所述融血试剂浓缩液包括质量百分含量如下的下列组分：6.如权利要求5所述的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述防腐剂为Proclin300。7.一种联合检测多种炎症生物标志物的方法，其特征在于，至少包括以...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶雷，
申请(专利权)人：深圳赛斯鹏芯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44