纤维化的联合生物标志物测量制造技术

本文提供了用于检测交联的PIIINP的夹心免疫测定法，交联的PIIINP具有通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP链，每条链具有由完整的III型前胶原的N蛋白酶切割产生的PIIINP的C末端新表位。具有交联的PIIINP的生物样品与第一表面结合单克隆抗体接触，然后与第二单克隆抗体接触，两种抗体都是与PIIINP的C末端序列中的新表位特异性反应的，并且然后测定第二单克隆抗体的结合。还提供了一种通过免疫测定和试剂盒评估靶向赖氨酰氧化酶的拮抗剂药物的功效的方法，试剂盒包含结合第一单克隆抗体的固体载体并且包含第二单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纤维化的联合生物标志物测量
本专利技术涉及用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定及其在评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物功效中的用途。本专利技术还涉及用于进行夹心免疫测定的试剂盒。
技术介绍
纤维化疾病(包括表1中列出的疾病)是发病和死亡的主要原因，例如，全球每年有800,000人死于肝硬化(1)。表1.不同的纤维化疾病(2)“纤维化疾病”是任何引起无论是作为主要还是次要症状的纤维化的疾病。纤维化是由多种刺激引起的慢性炎症反应的最终结果，刺激包括持续感染、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤。纤维化的特征在于细胞外基质(ECM)的积聚和重组。尽管有明显的病因和临床特性，但大多数慢性纤维化病症都有一个共同点，都具有持续性刺激物质，该刺激物质维持生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维化细胞因子的产生，这些刺激物质一起刺激结缔组织成分的沉积，特别是胶原和蛋白多糖，这逐步重构和破坏正常的组织结构(3、4)。尽管它对人类健康有巨大的影响，但目前还没有经批准的直接针对纤维化机制的治疗(5)。细胞外基质(ECM)ECM是一种超分子结构，具有形成蛋白质聚集体的能力，因此形成在三维网络中将细胞连接在一起的动态支架。该支架通过上调和下调蛋白酶来控制细胞-基质相互作用和细胞命运(6)。ECM由胶原、层粘连蛋白、蛋白多糖和其他糖蛋白以各种数量和组合组成，从而提供多种生物成分，该成分可被蛋白酶修饰以产生具有特定功能的支架来满足个体组织的需求(7)。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是人体内主要的结构蛋白质。III型胶原对于心血管系统和其他器官中的I型胶原的原纤维的生成是必需的(8、9)。在纤维组装期间，在将成熟胶原并入ECM中之前，III型前胶原的N末端前肽(由三条相同的α链组成，总共分子量为42kDa)被特异性N蛋白酶切割。切割的前肽可以保留在ECM中或释放到循环中。然而，前肽的切割有时是不完全的，使前肽附连至分子。这导致形成具有异常交联的细纤维，这反过来导致异常分子容易发生快速代谢更新(10、11)。因此，合适样品中III型胶原的N末端前肽(PIIINP)的水平可以作为III型胶原形成和/或降解的标志物。ECM的重构在各种疾病的发病机理中起重要作用，因为ECM改变的成分和非编码修饰引起组织僵硬以及完整ECM及其片段的信号电位的变化。ECM重构是组织功能和修复的重要前提，并由负责ECM合成和降解的酶的严格控制。在病理事件期间，诸如纤维化疾病，ECM的形成和降解之间的平衡受到干扰，引起ECM的组成改变。这种改变导致组织功能改变(12、13)。已经提出PIIINP可以用作几种纤维化疾病的生物标志物，诸如肺损伤(14)、病毒性和非病毒性肝炎(15)、系统性硬化症(16)、血管重构(17)和肾病(18)。骨骼肌组织中的ECM重构被给予了有限的关注。在大鼠模型中，在运动后的股四头肌和胫骨前肌中证实了增加的胶原基因表达和生物合成(19、20)。此外，在运动后的临床研究中证实了升高的血清PIIINP水平(21)。因此，骨骼肌蛋白质的重构增加PIIINP在循环中的量，并且可以用作检测早期肌肉合成代谢的生物标志物。先前已经提出血清PIIINP水平作为肌肉组织应答睾酮(22)、重组人生长激素(23)或其组合(24、25)的生物标志物。在肝纤维化中，I型和III型原纤维胶原高度上调(26、27)。III型胶原在纤维化的早期阶段占主导地位，而I型胶原的上调与纤维化的后期阶段相关。肝脏中发生纤维化导致胶原沉积和前肽释放，主要是PIIINP。因此，PIIINP是用于纤维发生的最好研究标志物之一(28、29、30)。多年来，已开发了几种用于定量检测PIIINP的放射免疫测定，灵敏度高达94％，检测肝硬化的特异性高达81％(31,32)；然而以前的测定均无新表位特异性。另外，目前市售的用于定量PIIINP的测定利用靶向前胶原或前肽的内部序列的多克隆抗体或单克隆抗体，并且不特异性地区分III型胶原(31、32)的形成和/或降解。因此，为了区分III型胶原的形成和降解，我们认为有必要测定和检测仅仅在形成过程中产生的新表位片段(即在III型胶原的形成中产生，但是在III型胶原的降解中不产生的片段)。WO2014/170312公开了一种对包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH(SEQIDNO：4)的末端氨基酸中的C末端PIIINP新表位具有特异性的单克隆抗体，其中X可以是Gly或Pro。Brocks(31)公开了一种针对修饰的牛C末端PIIINP序列IC*QSCPTGGENYSP-COOH(SEQIDNO：1)(C*＝乙酰氨基保护的Cys；Gln被Glu(E)代替)的多克隆抗体，然而所述抗体对牛C末端PIIINP序列ICQSCPTGGQNYSP-COOH(SEQIDNO：2)的末端氨基酸是非特异性的，并且另外所述抗体不识别人PIIINP。Bayer(33)公开了一种夹心ELISA，其使用针对序列H2N-GSPGPPGICQSCPTGPQNYSP-COOH(SEQIDNO：3)的检测器单克隆抗体，但结合表位未确定。本申请人现在已经发现，利用WO2014/170312中公开的针对PIIINP的C末端新表位的新表位特异性抗体的特异性夹心免疫测定可用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物的功效，特别是LOX拮抗剂药物。通过LOX酶促胶原交联和胶原的加工是组织成熟和稳定性的关键。在器官纤维化患者中，胶原变得高度交联，因此不易纤维化消退。LOXL2是一种特异性LOX，是纤维化组织中病理生理性胶原交联的主要驱动，目前正在进行新型LOXL2拮抗剂的临床试验。因此，可用于评估靶向LOX的药物(例如LOX拮抗剂)功效的测定显然将是制药工业的有用工具。
技术实现思路
本专利技术涉及用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定法，其中交联的PIIINP包括通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP。该方法包括使包括交联的PIIINP的生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触，其中包括在交联的PIIINP中的PIIINP每条链具有由N蛋白酶切割完整的Ⅲ型前胶原产生的PIIINP的C末端新表位；以及加入第二单克隆抗体。两种单克隆抗体都是与PIIINP的C末端新表位特异性反应的，并且所述新表位包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH中，其中X是Gly或Pro。该方法还包括测定第二单克隆抗体的结合量。本专利技术还涉及用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗剂药物的功效的方法。该方法包括使用本文所述的夹心免疫测定法定量至少两种生物样品中交联的PIIINP的量，生物样品是在向受试者给药拮抗剂药物期间的第一时间点和至少一个随后的时间点从该受试者获得的。在给药拮抗剂药物期间从所述第一时间点至该至少一个随后的时间点，交联的PIIINP的量的减少指示靶向LOX的拮抗剂药物有效。本专利技术还涉及用于如本文所述的夹心免疫测定法的试剂盒。该试剂盒包括固体载体，如上所述的第一单克隆抗体结合于该固体载体，和如本文所述的标记的第二单克隆抗体。附图说明图1：人(SEQIDNO：14)和大鼠(SEQIDNO：15)物种中的靶向PIIINPα1链序列的比对(使用方框突出显示)。在III本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定法，所述交联的PIIINP包括通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP链，所述方法包括：使包括所述交联的PIIINP的所述生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触，其中包括在所述交联的PIIINP中的PIIINP每条链包括由N蛋白酶切割完整的Ⅲ型前胶原产生的PIIINP的C末端新表位；加入第二单克隆抗体；以及测定所述第二单克隆抗体的结合量；其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体都是与所述PIIINP的C末端新表位特异性反应的，所述新表位被包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP‑COOH中，其中X是Gly或Pro。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.03 US 15/014,2411.一种用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定法，所述交联的PIIINP包括通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP链，所述方法包括：使包括所述交联的PIIINP的所述生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触，其中包括在所述交联的PIIINP中的PIIINP每条链包括由N蛋白酶切割完整的Ⅲ型前胶原产生的PIIINP的C末端新表位；加入第二单克隆抗体；以及测定所述第二单克隆抗体的结合量；其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体都是与所述PIIINP的C末端新表位特异性反应的，所述新表位被包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH中，其中X是Gly或Pro。2.根据权利要求1所述的夹心免疫测定法，其中所述单克隆抗体基本上不识别或结合所述C末端氨基酸序列的延长形式CPTGXQNYSPQZ-COOH，其中Z不存在或者是所述III型胶原序列的一个或多个氨基酸。3.根据权利要求1或2所述的夹心免疫测定法，其中所述夹心免疫测定法用于定量生物样品中交联的PIIINP的量。4.根据权利要求3所述的夹心免疫测定法，还包括将由所述方法测定的交联PIIINP的量与已知疾病严重程度的标准纤维化疾病样品相关联以评估纤维化疾病的严重程度。5.根据权利要求4所述的夹心免疫测定法，其中所述纤维化疾病是肝病。6.根据权利要求3至5中任一项所述的夹心免疫测定法，其中所述生物样品是生物流体。7.根据权利要求6所述的夹心...

【专利技术属性】
技术研发人员：费德里卡·杰诺韦塞，梅特·尤尔·尼尔森，莉萨·拉森，黛安娜·朱莉·奥尔内斯利明，莫滕·卡斯达尔，
申请(专利权)人：北欧生物科技公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK