一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，包括包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠、BNP校准品溶液、铕标记的BNP单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。所述的包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1~3μm的超顺磁珠与BNP单克隆抗体共价偶联物。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，BNP的灵敏度为10pg/mL，血清(浆)样本不需要稀释；检测时间短，30min出报告；样品需求量少，一次上样只需50μL；配套全自动时间分辨免疫分析仪，操作简单，无人为误差并节省人力。

BNP kit for magnetic beads time resolved fluorescence immunoassay

The invention discloses a magnetic bead time-resolved fluorescence immunoassay kit for quantitative detection of BNP, which comprises an immunomagnetic bead coated with BNP monoclonal antibody, a BNP calibration solution, a Eu-labeled BNP monoclonal antibody solution, a cleaning solution and a strengthening solution. The immunomagnetic beads coated with BNP monoclonal antibodies are covalent conjugates of superparamagnetic beads with a diameter of 1~3 microns modified by functional groups and BNP monoclonal antibodies. The kit has high sensitivity, the sensitivity of BNP is 10pg/mL, and the serum (plasma) sample does not need to be diluted; the detection time is short, and the report is made in 30 minutes; the sample demand is small, and the sample only needs 50 mu L at a time; and the fully automatic time-resolved immunoassay instrument is equipped with simple operation, no human error and labor saving.

【技术实现步骤摘要】
一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒
本专利技术涉及体外试剂检测
，具体地说，涉及一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒。
技术介绍
心力衰竭(heartfailure，HF)是指各种心脏结构或功能性疾病引起的心室充盈及射血能力受损导致心排血量不能满足机体代谢的需要，器官、组织血液灌注不足的一种综合征，临床上常表现为呼吸困难、运动耐量下降及循环淤血或水肿。B型脑钠肽(BrainNatriureticPeptide，BNP)是心室分泌的一类激素片段，是含76个氨基酸的多肽，通过心肌细胞拉伸进入血液循环，不具有生物学活性，最终由肾脏清除。BNP是心室最主要的利钠肽，其在血液中代谢途径不会受肾脏代谢的影响，浓度升高能反映心衰时心室压力升高和容积增加。因此，BNP与其他利钠肽及其前体相比是评价心室负荷更敏感和特异的指标，可用于慢性心力衰竭的诊治。BNP不仅是心力衰竭灵敏而特异的指标，也是稳定和不稳定性冠心病治疗、诊断、预后的重要因素，有助于预测以后发生心力衰竭和死亡的危险。2014年在中国急性心力衰竭和治疗指南中明确提出将BNP作为急性心衰诊断指标。欧洲心脏病协会将BNP检测列入诊断或排除心衰指南。BNP测定结果结合病史、临床表现、心电图、胸片和其他心肌标志物检测可为充血性心力衰竭的临床诊断、治疗和预后评价提供有价值的信息。目前检测BNP的方法主要有荧光免疫层析法、化学发光法、电化学发光法。荧光免疫层析法虽然操作简单、检测时间短，但其存在检测灵敏度低、准确度较差、重复性差等缺点；化学发光法和电化学发光法虽然具有灵敏度和准确度高、线性范围宽等优点，但是存在仪器设备昂贵、检测时间长等缺点，不适合基层社区医院使用。因此，我们需要更快提供准确结果的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒。本专利技术将时间分辨荧光免疫分析技术与磁微粒相结合，提供了一种成本低廉、操作简单、准确、灵敏度高、检测范围宽的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒。本专利技术的基于磁微粒的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，能够定量检测样品中BNP含量，检测结果更加准确可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。本专利技术提出的检测方法将大大提高HF、AMI(acutemyocardialinfarction，AMI)诊断率，在HF、AMI早期诊断、疗效观察和预后判断中发挥越来越重要的作用。为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，包括包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠、BNP校准品溶液、铕标记的BNP单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。在上述磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒中，所述的包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1～3μm的超顺磁珠与BNP单克隆抗体共价偶联物，其中所使用的磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠中的一种或几种。在上述磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒中，所述的单克隆抗体为针对BNP不同表位的抗体。在上述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒中，所述免疫磁珠的制备方法为直径1～3μm的磁微粒与所述对应单克隆抗体经洗涤、活化、偶联、封闭制备得到。所述包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠的制备方法为：吸取羧基磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.05MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸洗涤磁珠3～5次；向上述洗涤好的磁珠中加入0.05MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸，加入20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和20mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应；将活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠；加入单克隆抗体，室温持续旋转孵育3～5小时，反应时间取决于磁珠的配位基与浓度；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠；加入含有2％BSA0.1MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联单克隆抗体的活化羧基位点，反应30～60分钟；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，加入免疫磁珠保存液。所述的保存液为含5％(w/v)BSA，1％(w/v)海藻糖，0.1％(v/v)Tween-200.05MpH8.0的Tris-HCl缓冲液。所述的铕标记BNP抗体的制备方法为：按照BNP抗体与Eu3+的质量比为4:1，将DTTA-Eu作为标记物，在0.05MpH8.5的碳酸盐缓冲液下，加入DTTA-Eu与BNP单克隆抗体，混合后溶于0.05MpH8.5的碳酸盐缓冲液，室温震荡过夜；用葡聚糖凝胶柱纯化后收集峰管；将上述制备好的铕标抗体稀释，使BNP抗体的终浓度为0.0045～0.0080g/L。所述清洗液的配方为：0.8～1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH7.2～7.50.01MTris-HCl缓冲液。所述增强液的配方为：0.03％乙酸钠、0.0002～0.0009％β-NTA、0.0024％TOPO、0.08％醋酸、0.1％无水乙醇、0.01％的TritonX-100的水溶液。所述BNP校准品的制备方法为：用含1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH7.50.02MTris-Hcl缓冲液将BNP抗原稀释至0、50、100、500、1000、2500pg/ml。所述荧光物质的激发波长为300～350nm，发射波长为500～650nm。本专利技术所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒的检测原理为夹心法，试剂条的反应孔中预装有BNP免疫磁珠，测试时，先将待测样本(血清或血浆)或者校准品加到试剂的反应孔中，振荡孵育10min，洗涤后再加入铕标BNP抗体，振荡孵育10min，形成免疫磁珠-抗原-铕标抗体复合物。洗涤后，再加入增强液，在激发光的作用下，荧光物质发射一定波长的光信号，被免疫荧光检测仪识别，样本中被测物越多，产生的荧光信号强度越强。将BNP校准品浓度与荧光信号值拟合剂量-反应曲线，即可按此测值得到未知样本中BNP浓度。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)采用磁分离技术，形成的免疫复合物在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可以将免疫复合物与未结合物质分离。因磁珠具有更大的结合面积与能在液相中分散而充分反应，大大提高检测范围，缩短反应时间，提高灵敏度。由于磁珠与抗原或抗体为共价偶联，克服了物理吸附的不稳定性，因此免疫磁珠保存时间久且更稳定。(2)采用时间分辨荧光免疫分析技术，采用镧系螯合物铕、铽、钐、镝作为标记物，其具有较宽的激发光谱、较窄发射光谱，有利于降低本底，提高灵敏度；紫外光激发具有较高量子产率、较大Stokes位移，避免激发光谱和荧光发射光谱以及生物基质发射的光谱重合，荧光衰变时间长等优点，比传统荧光物质检测范围更宽、特异性更好。(3)配套全自动检测仪器，实现自动化操作，可同时检测一份或多份样本中BNP含量，样本用量少，操作简便快速(30分钟即可出结果)、为早期诊断HF和AMI提供重要依据，为病人节约了宝贵的时间。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，其特征在于包括包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠、BNP校准品溶液、铕标记的BNP单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。

【技术特征摘要】
1.一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，其特征在于包括包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠、BNP校准品溶液、铕标记的BNP单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。2.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，其特征在于，所述的包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1~3μm的超顺磁珠与BNP单克隆抗体共价偶联物，其中所使用的超顺磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠中的一种或几种。3.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，其特征在于，所述包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠的制备方法为：吸取羧基磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.05MpH6.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸洗涤磁珠3~5次；向上述洗涤好的磁珠中加入0.05MpH6.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸，加入20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和20mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应；将活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠；加入单克隆抗体，室温持续旋转孵育3~5小时；磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠。4.如权利要求3所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测BNP试剂盒，其特征在于，所述包被BNP单克隆抗体的免疫磁珠还加入含有2%BSA0.1MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联单克隆抗体的活化羧基位点，反应30~60分钟。5.如权利要求4所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：李根平，解巧丽，
申请(专利权)人：广州源起健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44