改进的P2X7受体结合剂和包含其的多肽制造技术

本发明专利技术涉及与P2X7受体结合的氨基酸序列和多肽。具体而言，本发明专利技术涉及与P2X7受体结合的改良的重链免疫球蛋白单可变结构域(本文也称为“ISV”或“ISVD”)，以及包含此类ISVD的蛋白质，多肽和其他构建体，化合物，分子或5化学实体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的P2X7受体结合剂和包含其的多肽本专利技术涉及与P2X7受体结合的氨基酸序列和多肽。具体而言，本专利技术涉及与P2X7受体结合的改良的重链免疫球蛋白单可变结构域(本文也称为“ISV”或“ISVD”)，以及包含此类ISVD的蛋白质，多肽和其他构建体，化合物，分子或化学实体。本专利技术提供的抗P2X7受体ISVD在本文中也称为“本专利技术的P2X7结合剂”或“P2X7结合剂”。本文中所述的抗P2X7受体多肽，构建体，化合物，分子或化学实体在本文中也称为“本专利技术的多肽”或“本专利技术的化合物”。从以下进一步的描述可以清楚地看出，本专利技术提供了两种不同组的P2X7结合剂，在本文中通常分别称为“基于3c23的P2X7结合剂”，“基于3c23的结合剂”或“基于3c23的结构单元”，以及“基于1c81的P2X7结合剂”，“基于1c81的结合剂”或“基于1c81的结构单元”。在这方面，本专利技术不仅提供了这些P2X7结合剂和包含其的化合物和多肽，而且还提供了包含至少一个(例如一个或两个)这种基于3c23的结合剂和至少一个(如一个或两个)基于1c81的结合剂的双互补位(如本文所定义的)多肽。本专利技术提供的多肽和化合物优选为融合蛋白。而且，如本文进一步描述的，本专利技术的多肽还可以具有延长的半衰期(如本文所定义)，并且为此目的可以例如还包含至少一个与血清蛋白例如人血清白蛋白结合的ISVD。本专利技术的多肽优选还包含C-末端延伸X(n)(如本文进一步所述)。基于本文的公开，本专利技术的其他方面，实施方案，特征，用途和优点对于本领域技术人员将是清楚的。嘌呤核苷酸作为细胞外信号传导分子被很好地建立。P2X受体是例如在脑和脊髓的不同区域介导快速兴奋性传递的ATP-门控阳离子通道。P2X7亚型在长期暴露于ATP期间具有改变其离子选择性的不寻常性质，其导致通道孔隙的进行性扩张和对大至900Da的分子的渗透性的发展。P2X7受体最初描述于造血起源的细胞中，包括巨噬细胞，小胶质细胞和某些淋巴细胞，并介导Ca2+和Na+离子的流入以及促炎细胞因子的释放。P2X7受体可能通过其调节白介素-1β(一种神经变性，慢性炎症和慢性疼痛中的关键介质)的加工和释放的能力来影响神经元细胞死亡。P2X7受体的激活提供了炎症刺激，并且P2X7受体缺陷型小鼠显著减弱了炎症反应，包括神经性和慢性炎性疼痛的模型。此外，通过调节促炎细胞因子的释放，P2X7受体活性可能参与抑郁症的病理生理学。因此P2X7受体可以代表神经和免疫系统之间的关键通讯联系(Skaper等，2010FASEBJ.24：337-345)。P2X7受体定位于免疫系统的关键细胞，加上其释放来自这些细胞的重要炎症介质的能力，表明P2X7受体拮抗剂在治疗广泛疾病包括疼痛和神经退行性疾病中的潜在作用，而提供治疗性开发的目标。在凋亡性细胞死亡是疾病的重要机制的癌症中，与正常组织相比，在凋亡中具有直接作用的P2X7具有显著作用，因为它在皮肤癌和子宫上皮癌中所显示。在啮齿动物模型中糖尿病视网膜的早期凋亡细胞死亡与该部分眼睛中的P2X7活化相关，提示可能与糖尿病微血管损伤有关。据报道，在基于家族的定量遗传关联研究中，P2X7受体多态性可能与高血压有关，P2X7的第一个内含子中的单核苷酸多态性rs591874与夜间舒张压具有强关联。P2X7受体在心血管系统细胞中表达，影响该信号系统的药物可能提供新的高血压疗法和血栓事件的预防。P2X7受体在健康肾脏中的表达很少(如果有的话)。相反，在患病的肾脏组织中P2X7的表达增加，并且肾脏疾病的两种啮齿动物模型的肾小球的免疫组织化学已经显示主要表达在足细胞，内皮和系膜细胞中。已经描述了P2X7受体对多囊肾病和肾纤维化的潜在作用。由于ATP在神经传递和神经调节中起关键作用，嘌呤受体亚家族(包括P2X7)已经参与各种病理状况。中枢神经系统(CNS)障碍的这种病理生理学包括脑外伤，局部缺血，神经退行性疾病和神经精神疾病。当损伤发生时，大量的ATP在细胞外环境中释放，这对触发细胞对创伤的反应是重要的。在这种情况下，P2X4和P2X7的表达水平发生改变，这可能会刺激休眠小胶质细胞向损伤部位的迁移和趋化。P2X7在控制小胶质细胞增殖和死亡中发挥重要作用。脑缺血可以产生并加剧包括中风在内的中枢神经系统的问题，并且有可能由小胶质细胞表达的P2X7受体(P2X7R)由于葡萄糖/氧剥夺而参与皮质损伤。神经炎症在许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森氏病的发病机理中起主要作用。虽然精确的机制是模糊的，小胶质细胞中信号转导通路的失调可能增强炎症，导致突触功能障碍并最终导致神经元细胞死亡。P2X7受体的表达和功能在阿尔茨海默病患者和各种神经退行性疾病动物模型的死后脑中显著上调。这支持P2X7R途径在神经变性进程中的作用。已显示阻断P2X7R导致各种动物模型中神经病理学的改善。总之，这些结果表明，P2X7R信号途径构成治疗各种神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病和亨廷顿舞蹈病的治疗靶点。可结合P2X7受体的ISVD(特别是纳米抗体)及其用途在本领域中是已知的，特别是从WO2010/070145和WO2013/178783已知。WO2013/178783公开了作为SEQIDNO：12的被称为3c23的抗-P2X7受体纳米抗体(参见本文的SEQIDNO：87)。在本申请中，使用具有与3c23相同序列，但是与3c23相比具有人源化A14P和Q108L取代的参照纳米抗体(在本文中称为“参比A”)。3c23的氨基酸序列和参比A的氨基酸序列(连同其根据Kabat和Abm惯例的CDR；注意SEQIDNO：4和7是相同的)在下表A中作为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2至7给出。WO2013/178783还公开了作为SEQIDNO：6的被称为1c81的抗P2X7受体纳米抗体(参见本文的SEQIDNO：88)。在本申请中，使用具有与1c81相同的序列但是与1c81相比具有人源化A14P和Q108L取代的参考纳米抗体(在本文中称为“参比B”)。1c81和参比B的氨基酸序列(连同其根据Kabat和Abm惯例的CDRs；注意SEQIDNO：11和14是相同的)在下表B中以SEQIDNO：8和SEQIDNO：9到14给出。表A：3c23，参比A及其CDR。表B：1c81，参比B及其CDR。本专利技术旨在提供改进的P2X7受体结合剂，特别是改进的抗P2X7受体ISVD，更特别是改进的抗P2X7受体纳米抗体。本专利技术还旨在提供包含至少一种此类抗P2X7受体ISVD的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体。这样的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体优选如本文进一步描述的。更具体而言，本专利技术旨在提供改进的P2X7受体结合剂，其是3c23和参照A的变体，并且具有被干扰因子(通常称为“先前存在的抗体”)降低的结合，所述干扰因子可能存在于来自一些健康人类受试者和患者的血清中。参考WO12/175741，WO2013/024059以及例如Hollandetal.(J.Clin.Immunol.2013，33(7)：1192-203)以及受让人于2015年5月13日提交的标题为“改进的免疫球蛋白可变结构域”的共同待决的未提前公开的PCT申请PCT/EP2015/060643。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与P2X7受体结合的免疫球蛋白单可变结构域，其具有：‑CDR1，所述CDR1(根据Kabat)为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)；和‑CDR2，所述CDR2(根据Kabat)为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)；和‑CDR3，所述CDR3(根据Kabat)为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)；并具有：‑与SEQ ID NO：1的氨基酸序列(其中可能存在的任何C‑末端延伸以及CDR不被考虑用于确定序列同一性程度)具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的程度的序列同一性；和/或具有：‑与SEQ ID NO：1的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11，89，110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且任选地(即当以单价形式或当存在于本专利技术的多肽的C‑末端时)具有：‑C端延伸(X)n，其中n为1至10，优选1至5，例如1，2，3，4或5(并且优选1或2，如1)，并且每个X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选择，并且优选独立地选自由丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组；和任选地(即当以单价形式或当存在于本专利技术多肽的N‑末端时)在位置1具有D(即与SEQ ID NO：1相比的EID突变)，其中：‑基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和‑基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和‑基于3c23的结合剂的位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和‑基于3c23的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L和位置11是V；或(iii)位置89是L，和位置110是K或Q；或(iv)位置89是L，和位置112是K或Q；或(v)位置89是L，和位置11是V，和位置110是K或Q；或(vi)位置89是L，和位置11是V，和位置112是K或Q；或(vii)位置11是V，和位置110是K或Q；或(vii)位置11是V，和位置112是K或Q。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.12 US 62/254,2981.与P2X7受体结合的免疫球蛋白单可变结构域，其具有：-CDR1，所述CDR1(根据Kabat)为氨基酸序列HYAMG(SEQIDNO：2)；和-CDR2，所述CDR2(根据Kabat)为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQIDNO：3)；和-CDR3，所述CDR3(根据Kabat)为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQIDNO：4)；并具有：-与SEQIDNO：1的氨基酸序列(其中可能存在的任何C-末端延伸以及CDR不被考虑用于确定序列同一性程度)具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的程度的序列同一性；和/或具有：-与SEQIDNO：1的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11，89，110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且任选地(即当以单价形式或当存在于本发明的多肽的C-末端时)具有：-C端延伸(X)n，其中n为1至10，优选1至5，例如1，2，3，4或5(并且优选1或2，如1)，并且每个X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选择，并且优选独立地选自由丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组；和任选地(即当以单价形式或当存在于本发明多肽的N-末端时)在位置1具有D(即与SEQIDNO：1相比的EID突变)，其中：-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和-基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和-基于3c23的结合剂的位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和-基于3c23的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L和位置11是V；或(iii)位置89是L，和位置110是K或Q；或(iv)位置89是L，和位置112是K或Q；或(v)位置89是L，和位置11是V，和位置110是K或Q；或(vi)位置89是L，和位置11是V，和位置112是K或Q；或(vii)位置11是V，和位置110是K或Q；或(vii)位置11是V，和位置112是K或Q。2.与P2X7受体结合的免疫球蛋白单可变结构域，其具有：-CDR1，...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽安格·比斯，卡特林恩·斯托特勒斯，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE