一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物。本发明专利技术还公开了一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术提供的引物、试剂盒及检测方法在检测洪湖碘泡虫上灵敏度高、特异性强、重复性好、快速简便，最低可检测302个拷贝，不仅能从感染鱼的组织中检测出洪湖碘泡虫，也能从周年发病池塘的水样、泥样等环境样品中检测出洪湖碘泡虫，实现对养殖环境中的洪湖碘泡虫全生活史发育阶段时空动态的定量监测。本发明专利技术提供的引物、试剂盒及检测方法为鲫“喉孢子虫病”的早期快速诊断、监测、流行病学调查、苗种的产地检疫、“喉孢子虫病”发生的风险评估与预警、药效的评价及制定合理防控对策均可提供技术支撑。

A real-time fluorescent quantitative PCR detection primer, kit and detection method for Honghu iodine bubble worm

The invention discloses a real-time fluorescent quantitative PCR detection primer for Honghu iodide. The invention also discloses a real-time fluorescence quantitative PCR detection kit and a detection method for iodine pest in Honghu Lake. The primers, kits and detection methods provided by the invention have high sensitivity, strong specificity, good repeatability, fast and simple, and can detect 302 copies at least. The primers, kits and detection methods can not only detect the iodine pest in the tissues of infected fish, but also detect the iodine pest in the environmental samples such as the water samples and the cement samples of annually infected ponds. The iodine bubbles in Honghu Lake can be quantitatively monitored during the whole life cycle of iodine bubbles in the culture environment. The primers, reagent kits and detection methods provided by the invention can provide technical support for early and rapid diagnosis, monitoring, epidemiological investigation, quarantine of seedling origin, risk assessment and early warning of occurrence of laryngosporiasis, evaluation of pharmacodynamics and formulation of reasonable prevention and control countermeasures.

【技术实现步骤摘要】
一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及鱼类寄生虫检测领域，具体涉及一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
粘体动物(Myxozoa)是一类主要寄生于鱼类、少部分寄生于两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的后生动物寄生虫。据文献资料记载，寄生于异育银鲫的粘孢子虫种类超过40种，能导致病害的有10多种。异育银鲫是中国科学院水生生物研究所的鱼类育种专家于1976～1981年研制成功的一种鲫鱼养殖新对象它是利用天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授精繁育的子代。因其具有生长快、易饲养、抗逆性强肉质鲜美等优点，是我国重要的鲫鱼养殖品种。近年来，伴随着大规模集约化养殖的发展，异育银鲫粘孢子虫病害也日趋严重，不仅影响异育银鲫苗种培育，还危害成鱼养殖，给异育银鲫养殖业带来较大创伤。粘孢子虫具有复杂的生活史，其宿主包括鱼和底栖无脊椎动物，如水蚯蚓。研究表明，粘孢子虫生活史主要分为两个阶段(1)无性生殖阶段：粘孢子虫在宿主鱼体内无性生殖形成营养体，然后通过血液移行到靶器官发育成熟形成成熟孢子，孢子成熟后脱落或随着鱼体死亡、鱼体粪便、尿液排入水中沉到水底被底泥中水蚯蚓吞食(2)有性生殖阶段：成熟孢子在水蚯蚓体内行有性生殖发育、移行、并以放射孢子虫的形式释放到水中，水中的放射孢子虫又通过皮肤、鳃等器官感染宿主鱼并在体内发育成熟进入下一个生活史。洪湖碘泡虫(Myxobolushonghuensis)是危害鲫的重要病原体，也是危害异育银鲫最为严重的粘孢子虫。因其主要感染异育银鲫的咽喉部，俗称“喉孢子虫”。感染早期，鱼体无明显症状，随着感染程度加深，洪湖碘泡虫在鱼体咽部形成肉眼可见的孢囊，甚至取代整个咽部。目前我国对“喉孢子虫病”尚无有效的预防和治疗措施，主要原因是当今对该病的诊断以肉眼可见孢囊为标准，而孢囊形成后已是发病末期，药物难以进入几丁质的壳瓣，无法起到杀死虫子的效果。但当孢子虫在鱼体内处于营养体以及在水中处于放射孢子虫阶段往往是药物敏感期，从而达到预防的目的。因此，发展一种洪湖碘泡虫的早期检测方法检测鱼体内处于营养期的孢子、水体中的放射孢子和底泥中的孢子丰度尤为重要，以期为洪湖碘泡虫的早期诊断和病害防控奠定理论基础。目前关于洪湖碘泡虫的检测方法，主要有形态学方法、免疫学方法和聚合酶链式反应(PCR)分子生物学方法。形态学方法通过常规肉眼观察、光学显微镜或电镜检查成熟孢子；免疫学方法利用制备的抗体对粘孢子虫病原体进行检测；分子生物学方法根据粘孢子虫核糖体基因(rDNA)序列设计特异性引物，并对待测DNA模板进行PCR扩增，测序分析扩增片段，再与相应的基因序列进行比对，得出检测结果。虽然这些方法都能达到检测的目的，但仍有一些不足，比如，漏诊率高，易出现假阳性，操作繁琐，易污染，敏感性相对较低，耗时长等，最重要是无法对病原丰度进行定量。实时荧光定量PCR技术(rea1-timefluorescentquantitativePCR，Q-PCR)是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。目前已广泛应用于分子生物学研究，医学研究，临床疾病诊断，动物疾病检测等领域中，具有特异性强、重复性好、敏感性高、操作简便、耗时短和无污染等优点，已成为目前核酸定量检测的首选方法。因此，针对以上问题，建立一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测方法能够实现对鱼体内的营养期阶段、水体中的放射孢子和底泥中的孢子的丰度进行快速、准确的检测，以期为洪湖碘泡虫病害的有效防控提供重要的技术支持。
技术实现思路
专利技术目的：针对以上问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫的ITS序列。专利技术还要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫(Myxobolushonghuensis)的实时荧光定量PCR检测引物。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术还要解决的技术问题是提供洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒在洪湖碘泡虫的检测方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测方法。技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种洪湖碘泡虫的ITS序列，所述ITS序列如SEQIDNO：6所示。一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物，所述检测引物基于洪湖碘泡虫的ITS序列设计获得，所述检测引物包含正向引物HH-F和反向引物HH-R，引物序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，HH-F：5'CCACGTTTGTCAGAGTGATTGC3'；HH-R：5'GGTCGTATATTCACTGTCCGACT3'。一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒具体包括以下组分：组分工作液浓度HH-F10μMHH-R10μMReal-timePCRMix2×阳性标准品--阴性对照物(DD.H2O)--其中，所述阳性标准品是含有洪湖碘泡虫基因片段的重组质粒。该基因片段序列为：CCACGTTTGTCAGAGTGATTGCGGTATGTGATAATTGTTTACAATTATTATATATAATCTGGCAACTTTGCATACACTTTGGTTTTCGTAAGACAATCACATAAAGTTAGCATCGAGAGCAATGGAATATTATTGATCATTGTGTGTTCATCAAGTCGGACAGTGAATATACGACC，序列长度为176bp，序列如SEQIDNO:3所示。由于粘孢子虫rDNA基因序列包含18SrDNA、ITS-5.8SrDNA、28SrDNA三个部分，ITS序列位于核糖体DNA序列中的一段内转录间隔区序列，ITS序列不同于其两端的大小亚基基因，ITS区不加入成熟的核糖体，功能上不受限制，受到的选择压力较小，导致其在核苷酸长度和序列上出现了很大的变异，特别适合作为种间分类鉴定的分子标记。因此，选择ITS区域基因序列为靶标序列设计实时荧光定量PCR引物。其中，所述阳性标准品构建过程如下：(1)洪湖碘泡虫和吴李碘泡虫DNA获得：采用QIAGENDNeasyBlood&Tissue试剂盒按照说明书步骤提取洪湖碘泡虫DNA、吴李碘泡虫DNA，于－20℃保存。(2)洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列获取：分别以提取的洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫DNA作为模板，使用粘孢子虫18S通用上游引物F(SEQIDNO：4)18r-v:CGTAACAAGGTTTCCGTAG)和28S通用下游引物R(SEQIDNO：5)R(Myxo28S1F-V:CACTTCACTCGCAGTTACT)进行常规PCR扩增；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫目的条带DNA；分别将目的条带DNA与PMD‐18T载体连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化大肠杆菌DH5α成功的菌落纯化培养，PCR鉴定和筛选阳性克隆；将PCR鉴定成功的克隆菌液测序和序列拼接得到洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列；(3)实时荧光定量PCR引物设计：比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种洪湖碘泡虫的ITS序列，其特征在于，所述ITS序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种洪湖碘泡虫的ITS序列，其特征在于，所述ITS序列如SEQIDNO：6所示。2.一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述检测引物基于权利要求1的ITS序列设计获得，其检测引物序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。3.一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的检测引物的试剂盒。4.根据权利要求3所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：（1）Real-timePCRMix及权利要求2所述的检测引物的混合液；（2）阳性标准品；（3）阴性对照物。5.根据权利要求4所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品是含有洪湖碘泡虫基因片段的重组质粒。6.根据权利要求5所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该基因片段长度为176bp，所述基因片段序列如SEQIDNO:3所示。7.根据权利要求5所述的洪湖碘泡虫实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的构建方法包括如下步骤：（1）洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列获取：分别以提取的洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫DNA作为模板，使用粘孢子虫18S通用上游引物F和28S通用下游引物R进行常规PCR扩增；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫目的条带DNA；分别将目的条带DNA与PMD-18T载体连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化大肠杆菌DH5α成功的菌落纯化培养，PCR鉴定和筛选阳性克隆；将PCR鉴定成功的克隆菌液测序和序列拼接得到洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列；（2）实时荧光定量PCR引物设计：比对分析洪湖碘泡虫与吴李碘泡虫ITS序列，找出洪湖碘泡虫特异的ITS区域序列，将该区域序列作为靶标序列设计实时荧光定量PCR引物；引物序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：章晋勇，罗丹，赵媛莉，刘新华，吴伟，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42