用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’‑ATGACTCAAAAACAGGAACAT‑3’，下游引物：5’‑TACAAATTTACCACTTTCACATACTG‑3’，Taqman探针：5’‑AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT‑3’。本发明专利技术能够快速、有效地检测痢疾性阿米巴虫，所述非诊断性检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒灵敏、稳定、有效。

Primer probe, kit and method for quantitative detection of dysentery amoebae

The present invention discloses a fluorescent quantitative PCR detection kit for dysentery amoeba and a non diagnostic detection method. The kit includes PCR reaction liquid, which includes primers and Taqman probes having the following nucleotide sequences: upstream primers: 5 'ATGACTCAAAAACAGGAACAT ATGACTCAAAAACAGGAACAT 3', downstream primers: 5 'TACAAATTTAC TACAAATTTAC CACTTTCACATACTG \3\, Taqman probe: 5 \AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT\. The invention can quickly and effectively detect the dysentery amoeba. The non diagnostic detection method is accurate, specific and sensitive, and the detection kit is sensitive, stable and effective.

【技术实现步骤摘要】
用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物探针、试剂盒及方法
本专利技术涉及寄生虫的分子生物学检测
，特别是涉及一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
溶组织内阿米巴虫(Entamoebahistolytica)又称痢疾阿米巴虫，主要寄生于结肠内，引起阿米巴痢疾或阿米巴结肠炎。全世界约有5000万人感染，每年导致10万人死亡，其死亡率在原虫寄生虫中的患者中仅次于疟疾。目前检测痢疾性阿米巴虫所采用的方法主要还是传统常规的分离培养观察鉴定、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离培养鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率高；ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成误判。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今专利技术研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在检测上受到一些限制。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的痢疾性阿米巴虫检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒，使其能够快速、有效地对痢疾性阿米巴虫进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组，包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针引物。用于定量检测痢疾性阿米巴虫的试剂盒，其包括所述的引物组。所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针；所述定量检测指荧光定量PCR检测。所述探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团，5’端标记FAM荧光报告基团。所述试剂盒，还包括用于进行荧光定量PCR检测的常规试剂。所述常规试剂包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水；和/或，包括所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水在内的商品化PCR反应混合液；所述商品化PCR反应混合液为2×PremixEXTaq。一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的方法，其特征在于，采用所述的引物，和/或，所述的试剂盒对待测样品进行检测。所述检测指荧光定量PCR检测；所述荧光定量PCR的反应体系包括：上游引物终浓度0.2μM；下游引物终浓度0.2μM；Taqman探针终浓度0.2μM；所述待测样品的DNA10-100μg；2×PremixEXTaq终浓度为0.5μl/μl，余量为灭菌去离子水。所述荧光定量PCR的反应程序包括：95℃30s；以95℃5s，60℃34s，为1个循环，共进行40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。本专利技术提供的痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’-ATGACTCAAAAACAGGAACAT-3’，下游引物：5’-TACAAATTTACCACTTTCACATACTG-3’，Taqman探针：5’-AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT-3’。作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为痢疾性阿米巴虫基因组DNA。本专利技术的另一个目的是提供荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的非诊断性方法，可对痢疾性阿米巴虫快速、有效检测，且准确性、特异性和敏感性高。采用如下技术方案：痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR非诊断性检测方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：上游引物：5’-ATGACTCAAAAACAGGAACAT-3’，下游引物：5’-TACAAATTTACCACTTTCACATACTG-3’，Taqman探针：5’-AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT-3’。作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。所述荧光定量PCR的20μl反应体系包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品DNA1μl；2×PremixEXTaq10μl，余量为灭菌去离子水。所述荧光定量PCR反应条件为：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。由于采用上述技术方案，本专利技术至少具有以下优点：(1)本专利技术根据国内已发现的痢疾性阿米巴虫株(Entamoebahistolytica)(Genbank：AF501278.1)的hgl基因序列设计引物，合成特异性引物及Taqman-BHQ1探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测痢疾性阿米巴虫，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。(2)本专利技术一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-BHQ1探针荧光定量PCR检测法，使得利用Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR检测痢疾性阿米巴虫的灵敏度约是普通PCR的100倍。(3)由于采用定量检测技术-Taqman-BHQ1荧光定量PCR(Real-timePCR)，该方法(Real-timePCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。(4)Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。综上，由于采用了以上技术方案，本专利技术通过设计特异性引物和探针并优化荧光定量PCR的反应体系，发展了能够快速、有效地检测痢疾性阿米巴虫的荧光定量PCR的非诊断性检测方法，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，本专利技术通过大量实验验证，本专利技术的引物探针/试剂盒/检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达10个/mL，说明敏感性非常高，同时所述检测试剂盒批内变异系数在0.36％-0.47％之间，批间变异系数在1.03％-1.96％之间，说明稳定性良好。附图说明上述仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。图1是检测痢疾性阿米巴虫的荧光定量PCR扩增曲线。图2是痢疾性阿米巴虫Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR特异性检测结果；图中，1：痢疾性阿米巴虫；2：棘阿米巴虫；3：迪斯帕内阿米巴虫4：诺氏阿米巴虫；5隐孢子虫；6灭菌的去离子水。图3是痢疾性阿米巴虫Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的敏感性检测结果；图中，A：1×107个/mL；B：1×106个/mL；C：1×105个/mL；D：1×104个/mL；E：1×103个/mL；F：1×102个/mL；G：1×101个/mL；H：1×100个/mL。图4是痢疾性阿米巴虫Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的标准曲线。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物，包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针引物。2.用于定量检测痢疾性阿米巴虫的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针；所述定量检测指荧光定量PCR检测。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团，5’端标记FAM荧光报告基团。5.根据权利要求2-4任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行荧光定量PCR检测的常规试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述常规试剂包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水；和/或，包括所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新杰，高姗姗，孙晓明，胡祥钰，付婷婷，袁晓涛，
申请(专利权)人：北京亿森宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11