ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1多种基因变异的引物、试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供的用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物和探针是根据IDH1基因的第4号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列设计的，结合PCR平台可以检测IDH1基因的第4号外显子的包括R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V的多种突变，并对样本所携带IDH1基因变异DNA进行绝对数量；且引物扩增片段为91bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明专利技术提供的检测探针，可以从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1基因变异进行绝对定量检测，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

Primers, kits and detection methods for detecting IDH1 gene mutation by ddPCR Technology

The invention relates to the field of medicine and biotechnology, in particular to a primer, a kit and a detection method for detecting multiple gene variants of IDH1 by DD PCR technology. The primers and probes provided by the invention for detecting human IDH1 gene variation in ddPCR technology are designed according to the wild type gene sequence of the exon fourth of the IDH1 gene and the sequence of corresponding mutant genes, and the PCR platform can detect a variety of exon fourth of the IDH1 gene including R132H, R132C, R132S, R132G, R132L and R132V. The total number of IDH1 gene variant DNA carried by the sample is absolute, and the primer amplification fragment is 91bp, which is especially suitable for the amplification of the small fragment of DNA in the plasma free DNA and so on. In combination with the detection probe provided by the invention, the very low abundance of IDH1 gene mutation can be detected from cfDNA with good specificity and high sensitivity. It can be applied to the ddPCR platform for absolute quantitative detection of human IDH1 gene mutation, which plays an important role in guiding clinical treatment and improving the prognosis of patients.

【技术实现步骤摘要】
ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及医学和生物
，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1多种基因变异的引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的细胞质IDH3。编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitratedehydrogenase1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，目前发现的IDH1基因突变都发生在第4外显子的R132位，共发现了6种突变类型(包括R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V)，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。IDH突变超过90％是IDH1突变，几乎都是发生在酶的底物结合位点之一的残基R132的精氨酸。大约90％为精氨酸被组氨酸替代(R132H)，其他少见类型突变也都发生在R132残基，包括半胱氨酸(R132C；3.6％-4.6％)、丝氨酸(R132S；0.8％-2.5％)、甘氨酸(R132G；0.6％-3.8％)或亮氨酸(R132L；0.5％-4.3％)替代精氨酸。其中IDH1R132C突变与星形细胞瘤密切相关。有研究者分析了Li-Fraumeni综合征家族(TP53种系突变)中星形细胞瘤患者的IDH1突变，发现所有肿瘤的IDH1突变都发生在R132C，表明已经携带TP53突变的前体细胞可以产生这个相对稀有的IDH突变。IDH1酶底物结合位点中还有另外两个保守的精氨酸残基(8100和8109)，仅有一篇报道称在两例间变性少突胶质细胞瘤(WHOIII级)和一例星形细胞瘤(WHOII级)中存在R100Q突变。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南也将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别脑胶质瘤患者风险级别的指标之一。德国已出现了商业化的对IDH1R132H高度特异的单克隆抗体，可实现在常规免疫组化中对突变基因编码的蛋白进行特异性检测。由于可以简单纳入常规组织病理学工作，该抗体在德国临床诊断中得到了广泛应用。但是，针对其他类型的IDH1突变(R132C，R132S，R132L，R132G)单克隆抗体尚未商业化生产。用单克隆抗体检测突变为突变表型检测，通过检测突变基因的表达蛋白来检测基因突变，但由于受到肿瘤细胞基因表达调控的影响，常常不能真实反映基因突变情况。因此，现阶段，考虑到胶质瘤中IDH突变与预后密切相关，还需通过基因检测的方法来判断IDH基因是否存在突变。目前，对基因检测突变的分析的技术方法主要包括：测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。1.直接测序：Sanger测序法被认为是检测基因突变的金标准方法。但是，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，不易于形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。2.荧光定量PCR法：该方法灵敏度高、特异性好，是目前基因检测体外诊断试剂最常用的技术平台。但是，该方法需荧光标记的特异性探针，一种探针只能进行一种基因突变类型的检测，因此检测试剂成本高，检出突变种类少，操作相对复杂。对突变类型较多的IDH基因，该方法并不十分合适。3.限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5～10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。并且，目前通过基因检测判断与肿瘤相关的基因是否突变，往往需要对患者进行活体取组织样本。因此，迫切需要一种能够基于非肿瘤组织、高灵敏度、高准确性、可同时针对多种突变类型的患者中肿瘤相关基因突变的检测方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术提出一种ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法，本专利技术提供的用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物和探针是根据IDH1基因的第4号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列设计的，可以检测IDH1基因的第4号外显子的多种突变，本专利技术设计的引物和探针特异性强，并且以数字PCR为检测平台，判断待测样品中是否含有IDH1多种基因变异和发生突变的绝对含量及比例。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术首先提供了一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQIDNO：3所示，内参基因的TaqMan探针序列如SEQIDNO：4所示。进一步地，所述IDH1突变基因检测探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB荧光标记，内参基因的TaqMan探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB荧光标记。本专利技术的第二个目的在于提供一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的的方法，该方法具体包含以下步骤：1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；2)对所述的检测样本进行cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物；3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1变异基因和内参基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQIDNO：3所示，内参基因的TaqMan检测探针序列如SEQIDNO：4所示；4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1多种变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。进一步地，ddPCR反应体系中cfDNA模板的含量为0.3-2ng/μL。进一步地，ddPCR反应体系中扩增IDH1突变基因和扩增内参基因的上游引物的含量均为400-700nM，扩增IDH1突变基因和扩增内参基因的下游引物的含量均为400-700nM。进一步地，ddPCR反应体系中IDH1突变基因检测探针含量为200-400nM，内参基因的TaqMan检测探针含量为200-400nM。进一步地，步骤3)中ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟，93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。更进一步地，步骤3)中ddPCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。本专利技术还提出了一种用于绝对定量检测人IDH1基因变异的的试剂盒，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQIDNO：3所示，内参基因的TaqMan探针序列如SEQIDNO：4所示。2.根据权利要求1所述的一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述IDH1突变基因检测探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB荧光标记，内参基因的TaqMan探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB荧光标记。3.一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；2)对所述的检测样本进行cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物；3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1变异基因和内参基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQIDNO：3所示，内参基因的TaqMan检测探针序列如SEQIDNO：4所示；4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1多种变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。4.根据权利要求3所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昕昀，
申请(专利权)人：良培基因生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42