ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1多种基因变异的引物、试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供的用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物和探针是根据IDH1基因的第4号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列设计的，结合PCR平台可以检测IDH1基因的第4号外显子的包括R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V的多种突变，并对样本所携带IDH1基因变异DNA进行绝对数量；且引物扩增片段为91bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明专利技术提供的检测探针，可以从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1基因变异进行绝对定量检测，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

Primers, kits and detection methods for detecting IDH1 gene mutation by ddPCR Technology

The invention relates to the field of medicine and biotechnology, in particular to a primer, a kit and a detection method for detecting multiple gene variants of IDH1 by DD PCR technology. The primers and probes provided by the invention for detecting human IDH1 gene variation in ddPCR technology are designed according to the wild type gene sequence of the exon fourth of the IDH1 gene and the sequence of corresponding mutant genes, and the PCR platform can detect a variety of exon fourth of the IDH1 gene including R132H, R132C, R132S, R132G, R132L and R132V. The total number of IDH1 gene variant DNA carried by the sample is absolute, and the primer amplification fragment is 91bp, which is especially suitable for the amplification of the small fragment of DNA in the plasma free DNA and so on. In combination with the detection probe provided by the invention, the very low abundance of IDH1 gene mutation can be detected from cfDNA with good specificity and high sensitivity. It can be applied to the ddPCR platform for absolute quantitative detection of human IDH1 gene mutation, which plays an important role in guiding clinical treatment and improving the prognosis of patients.

【技术实现步骤摘要】
ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及医学和生物
，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1多种基因变异的引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的细胞质IDH3。编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitratedehydrogenase1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，目前发现的IDH1基因突变都发生在第4外显子的R132位，共发现了6种突变类型(包括R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V)，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。IDH突变超过90％是IDH1突变，几乎都是发生在酶的底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQIDNO：3所示，内参基因的TaqMan探针序列如SEQIDNO：4所示。2.根据权利要求1所述的一组用于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述IDH1突变基因检测探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB荧光标记，内参基因的TaqMan探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB荧光标记。3.一种基于ddPCR技术检测人IDH1基因变异的的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；2)对所述的检测样本进行cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物；3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1变异基因和内参基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1突变基因和内参基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，扩增IDH1突变基因和内参基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，IDH1突变基因检测探针序列如SEQIDNO：3所示，内参基因的TaqMan检测探针序列如SEQIDNO：4所示；4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1多种变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。4.根据权利要求3所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昕昀，
申请(专利权)人：良培基因生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42