用于变体检测的方法技术

本发明专利技术可用来提供检测DNA中的变体诸如SNP和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明专利技术还提供了用于进行便宜的多重测定的方法。

A method for variant detection

The invention can be used to provide more effective and less error prone methods for detecting variants in DNA, such as SNP and insertion / deletion. The invention also provides a method for cheap multiple determination.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于变体检测的方法
本专利技术可用来提供一种检测DNA中的变体诸如单核苷酸多态性(SNP)、多核苷酸多肽性(MNP)和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本专利技术还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法，并且提供了用于在二维图中可视化多个等位基因结果的方法。
技术介绍
RNA酶H2依赖的PCR(rhPCR)(参见美国专利申请公开号US2009/0325169A1，通过提及以其整体并入)和标准等位基因特异性PCR(ASPCR)均可用于突变检测。在ASPCR中，DNA聚合酶通过检测在引物的3’端或3’端附近的错配进行错配辨别。虽然ASPCR在错配检测中有时是成功的，但是由于野生型DNA聚合酶的低错配检测能力，辨别可能受限。与ASPCR相反，rhPCR中的RNA酶H2酶的错配灵敏度允许灵敏地检测DNA突变和从反应中消除引物-二聚体人工生成物。然而，当试图用rhPCR检测DNA突变时，引物内部的错配的定位是重要的。错配的位置越接近可切割的RNA，可从RNA酶H2酶观察到辨别越多，并且所得rhPCR测定的辨别越大。鉴于最常见的野生型DNA聚合酶诸如Taq经常显示出低水平的错配检测，在RNA酶H2切割后不能仅依赖该聚合酶进行该辨别。结合标准rhPCR的每个循环所需要的重复询问，当利用这些聚合酶时，不希望将错配放置在除了与RNA恰好相反之外的任何位置。
技术实现思路
本公开提供了利用高辨别聚合酶(highdiscriminationpolymerase)突变体或其它高错配辨别聚合酶的测定，以创造可利用位于RNA的5’的错配的新的测定设计。本专利技术可用来提供一种检测DNA中的突变(诸如SNP和插入/缺失)的更有效和不太易错的方法。本专利技术还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法。本专利技术的这些和其他优势以及另外的专利技术特征将从本文提供的本专利技术的描述中显而易见。附图说明图1为显示本专利技术中利用的两种引物设计的示意图。a)部分为封闭-可切割的引物，其被设计以使得当与模板杂交时感兴趣的SNP在RNA碱基的5’侧。RNA酶H2切割，留下3’询问碱基，通过高辨别力DNA聚合酶确定所述3’询问碱基为匹配或错配的。热循环允许该过程继续。b)部分示例说明RNA酶H2切割和SNP检测与a)相同，但是引物还包括5’“尾”结构域，其包括探针和通用正向引物的结合位点。在用RNA酶H2和该聚合酶辨别1-10个循环之后，高度浓缩的通用正向引物来主导扩增，当其扩增时降解探针。重复该循环25-50次，生成输出信号。该引物设计可为多重的，允许一管多色测定设计。图2A和2B为来自实施例1描述的测定的终点荧光图。将FAM和HEX荧光值标绘在X和Y轴上。图2A为用野生型Taq聚合酶进行的rs351855的“通用”SNP测定。图2B为用突变体H784QTaq聚合酶进行的rs351855的“通用”SNP测定，其证明了每个等位基因变体之间大大增强的辨别，如在突变体Taq的情况下由聚簇的更大分离所观察到的。在两种情况下，无模板对照(NTC)(正方形)在(0,0)坐标附近，如所希望的。等位基因1样品显示为圆形，等位基因2样品为菱形，并且杂合子为三角形。每个反应以一式三份进行。图3A和3B为rs4655751的基因分型判定的等位基因辨别图。反应板在反应建立后即刻循环(A)或在循环前在台面上在室温保持48小时(B)。菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因1样品；圆形：等位基因2样品；三角形：杂合子。基因型是紧密群集在一起的并且具有良好的角度分离，这表示优异的等位基因特异性。将每个样品分配为正确的基因分型判定，并且48小时保持时期内观察到无性能变化。图4A和4B示例说明来自基于TaqMan的测定与rhPCR的基因CCR2rs1799865的等位基因辨别图的并列比较。菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因1样品；圆形：等位基因2样品；三角形：杂合子。当显示一致结果时，与传统5’核酸酶基因分型测定(图4A)相比，rhPCR基因分型测定(图4B)实现了更高的荧光信号。图5A和5B为三等位基因SNP(CYP2C8(rs72558195))的等位基因辨别图，其QuantStudioTM7Flex平台(ThermoFisher)上使用rhPCR基因分型单管多重测定。在图5A中，菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因G(等位基因1)样品；圆形：等位基因A(等位基因2)样品；三角形：杂合子。在图5B中，菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因G(等位基因1)样品；圆形：等位基因C(等位基因3)样品；三角形：杂合子。图6显示出CYP2C8rs72558195的三等位基因的等位基因辨别360图，其使用rhPCR基因分型测定，在单个反应中复用3种等位基因特异性引物。图7为示例说明rhPCR测定进行定量基因分型的能力的等位基因辨别图。图8A和8B示例说明基因分型结果和本专利技术可以实现的等位基因的拷贝数变化的检测。使用不同拷贝数和不同参考基因型来测试gDNA样品。在图8A中，菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因G样品；圆形：等位基因C样品；和三角形：杂合子。所得数据与测试输入相关。图9为多重rhPCR的示意图。图10为所得TapeStation图像，其表示多重rhPCR方法在减少引物二聚体和增加所希望的扩增子产率中的有效性。图11图示了rh引物在映射读段和中靶读段的百分比中的有效性。具体实施方案本专利技术涉及利用封闭-可切割的rhPCR引物(见美国专利申请公开号US2009/0325169A1,通过提及以其整体并入本文)和具有高水平错配辨别力的DNA聚合酶的单核苷酸多态性辨别的方法。在一个实施方案中，错配位于除RNA碱基对面之外的位置。在这些情况下，辨别大部分不是来自RNA酶H2，而是来自所述高辨别聚合酶。封闭-可切割的引物与RNA酶H2的使用起减少或消除引物二聚体的作用，并且提供一些增加量的SNP或插入/缺失(插入/缺失)辨别(图1a)。为了本专利技术的目的，高辨别力被定义为超过野生型栖热水生菌(Taq)聚合酶的平均辨别力的任何量的辨别力。实例包括DNA聚合酶(WayneBarnes)，和在美国专利申请公开号US2015/0191707(通过提及以其整体并入本文)中所述的突变的聚合酶，诸如H784M、H784S、H784A和H784Q突变体。在一个另外的实施方案中，将通用检测序列添加到封闭-可切割的引物的5’端。检测序列包括探针的结合位点，和通用扩增引物的结合位点。引物结合位点位于最后的寡核苷酸的5’端或附近，并且探针结合位点位于通用引物位点和SNP检测引物结构域之间的内部。在检测反应中使用超过一个这样的嵌合探针，其中采用不同探针结合位点，允许引物被复用(complexed)，并且进一步允许SNP或其他基因组特征的多色检测。封闭-可切割的rhPCR引物减少或消除引物二聚体。引物二聚体是在SNP检测测定中使用“通用”引物设计的主要问题，并且这限制它们的效用(图1b)。将通用扩增/检测结构域与以封闭-可切割的引物形式的SNP引物结构域组合克服了该困难。以前，rhPCRSNP的最优选的实施方案采用封闭-可切割的引物，其具有位于单个RNA碱基(切割位点)对面的错配(SNP位点)。当其为许多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于rhPCR的封闭‑可切割的引物，所述引物包含：5’‑A‑B‑C‑D‑E‑3’其中，A为任选的，并且为不与靶标互补的尾延伸；B为与靶标互补的序列结构域；C为辨别结构域；D为可切割的结构域，当与所述靶标杂交时所述可切割的结构域可被RNA酶H2切割；并且E为封闭结构域，所述封闭结构域防止所述引物的延伸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.25 US 62/259,913;2016.05.20 US 62/339,3171.一种用于rhPCR的封闭-可切割的引物，所述引物包含：5’-A-B-C-D-E-3’其中，A为任选的，并且为不与靶标互补的尾延伸；B为与靶标互补的序列结构域；C为辨别结构域；D为可切割的结构域，当与所述靶标杂交时所述可切割的结构域可被RNA酶H2切割；并且E为封闭结构域，所述封闭结构域防止所述引物的延伸。2.权利要求1的引物，其中，D包含1-3个RNA碱基。3.权利要求1的引物，其中，D包含1个RNA碱基。4.权利要求1的引物，其中，所述可切割结构域包含以下部分中的一个或多个：DNA残基、脱碱基残基、修饰的核苷或修饰的磷酸核苷酸间连接。5.权利要求4的引物，其中，侧接所述切割位点的序列含有抗核酸酶切割的一个或多个核苷酸间连接。6.权利要求5的引物，其中，所述核酸酶抗性连接为硫代磷酸酯。7.权利要求2的引物，其中，所述RNA残基的至少一个的3′氧原子被氨基、巯基或亚甲基取代。8.权利要求1的引物，其中，所述封闭基团与所述引物的3′-末端核苷酸附接。9.权利要求1的引物，其中，A包含与通用正向引物相同的区域以及任选的探针结合结构域。10.一种检测靶DNA序列中的变异的方法，所述方法包括：(a)提供反应混合物，其包含(i)寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物具有位于封闭基团的5’并且位于变异位置的3’的切割结构域，所述封闭基团连接在寡核苷酸引物的3’端的末端或附近，其中所述封闭基团防止引物延伸和/或抑制所述引物用作DNA合成的模板，(ii)样品核酸，所述样品核酸可以具有或可以不具有所述靶序列，并且其中所述靶序列可以具有或可以不具有所述变异，(iii)切割酶和(iv)聚合酶；(b)使所述引物和所述靶DNA序列杂交以形成双链的底物；(c)如果所述引物在所述变异处是互补的，则在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的点处用所述切割酶切割所述杂交的引物，以从所述引物中去除所述封闭基团；和(d)用所述聚合酶延伸所述引物。11.权利要求10的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。12.权利要求10的方法，其中，所述切割酶为化学修饰的热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。13.权利要求12的方法，其中，所述热启动切割酶为化学修饰的深海火球菌(Pyrococcusabyssi)RNA酶H2。14.权利要求10的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶通过在较低温度下与抗体相互作用而可逆地失活，并且为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。15.权利要求10的方法，其中，所述切割结构域包含至少一个RNA碱基，并且，所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述RNA碱基之间切割。16.权利要求10的方法，其中，所述切割结构域包含一个或多个2’-修饰的核苷，并且所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述一个或多个修饰的核苷之间切割。17.权利要求16的方法，其中，所述一个或多个修饰的核苷为2’-氟核苷。18.权利要求10的方法，其中，所述聚合酶为高辨别力聚合酶。19.权利要求10的方法，其中，所述聚合酶为突变体H784QTaq聚合酶。20.权利要求19的方法，其中，所述突变体H784QTaq聚合酶经由化学、适配体或抗体修饰而可逆地失活。21.权利要求10的方法，其中，所述引物含有5’尾序列，所述5’尾序列包含通用引物序列和任选的通用探针序列，其中，所述尾与所述靶DNA序列为非互补的。22.一种用于对目标样品进行基因分型的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸从5’至3’包含：(a)加尾部分，其与所述目标样品为非互补的，但是(从5’至3’)含有与通用正向引物相同的第一序列，和与对应于等位基因的报告探针序列相同的第二序列；(b)与靶标互补的区域；(c)等位基因特异性结构域；和(d)含有封闭结构域的3’末端区域。23.权利要求22的寡核苷酸，其中，当与所述目标样品杂交时，所述等位基因特异性结构域能够被RNA酶H酶切割。24.权利要求22的寡核苷酸，其中，所述等位基因特异性结构域为5’-D-R-3’，其中，D为与感兴趣的SNP位置比对的DNA碱基，并且R为RNA碱基。25.权利要求22的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸为约15-30个碱基长。26.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·多博希，S·罗斯，包赟，王彧，陈才夫，M·A·贝尔克，P·W·曾，K·贝尔茨，G·雷蒂希，
申请(专利权)人：综合基因技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US