一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术制造技术

一种用于生物医学领域的SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术，其特征是将骨髓瘤细胞(Ag1)和抗骨髓瘤细胞抗体(Ab1)、B细胞(Ag2)和抗B细胞抗体(Ab2)分别按1∶1混合，使各自发生免疫结合，分别形成Ag1‑Ab1和Ag2‑Ab2的结合物，再将两种结合物按1∶1混合，此时Ag1‑Ab1结合物中Ab1的半数IgGFc段与Ag2‑Ab2结合物中Ag2的Fc受体结合，形成Ag1‑Ab1‑Ag2‑Ab2的结合物，使半数Ag1被Ab1连接到Ag2，此时加入金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，借助SPA的IgGFc受体，分别连接Ag1‑Ab1中未被结合的IgGFc和Ag2‑Ab2中未被结合的IgGFc，从而在SPA、Ab1和Ab2的作用下，特异性、有比例地拉近骨髓瘤细胞和B细胞的距离，在刀豆蛋白A、IFN‑γ和低浓度PEG的进一步作用下，易于胞膜的接触和融合。

A SPA mediated hybridoma technique with double antibody capture

A SPA hybridoma technique used in the biomedical field to mediate double antibody capture. It is characterized by mixing myeloma cells (Ag1), anti myeloma cell antibodies (Ab1), B cells (Ag2) and anti B cell antibodies (Ab2) respectively by 1: 1, respectively. The conjugates were mixed by 1: 1, at this time, half of the IgGFc segment of Ab1 in the Ag1 Ab1 conjugate was combined with the Fc receptor of Ag2 in the Ag2 Ab2 binding to form a Ag1 Ab1 Ag2 Ab2. Under the action of SPA, Ab1 and Ab2, the combination of IgGFc and Ag2 Ab2, which is not combined with SPA, Ab1 and Ab2, is specific and proportional to the distance between myeloma cells and B cells. It is easy to contact and fuse the membrane under the further action of the ConA protein A, IFN, and low concentration PEG.

【技术实现步骤摘要】
一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术
本专利技术涉及生物医学领域的一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术。
技术介绍
杂交瘤技术即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞杂交，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体--单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞杂交，则杂交细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，杂交的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。杂交细胞的另一方则是为了保持细胞杂交后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加杂交的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞杂交伴侣。杂交瘤技术是在细胞融合的基础上发展起来的，所以杂交瘤技术也称为细胞融合技术，细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经杂交后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。鉴于细胞DNA合成的两条途径，其中的主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。所以可用HAT培养基选择脾细胞和瘤细胞的有效融合，去除脾细胞和脾细胞、瘤细胞和瘤细胞的无效融合以及未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞、细胞的多聚体等形式的无效融合。目前，淋巴细胞杂交瘤技术仍沿用克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)创建的骨髓瘤细胞与免疫动物脾细胞杂交瘤技术(PEG法)，该技术建立在细胞融合的基础上，所用的细胞融合剂为聚乙二醇(PEG1000～2000)，虽然PEG仍是目前首选的融合剂，但PEG对细胞的毒性作用很大，浓度越高毒性越大，在有效融合剂量(50％～80％)范围的PEG仍对细胞有很大的毒性，这极大地影响了有效细胞融合率和融合后的细胞存活率。
技术实现思路
为了解决上述问题，建立一种低PEG剂量的、低毒性的、SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术，提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术。本专利技术的目的是这样实现的：将骨髓瘤细胞(Ag1)和抗骨髓瘤细胞抗体(Ab1)、B细胞(Ag2)和抗B细胞抗体(Ab2)分别按1∶1混合，使各自发生免疫结合，分别形成Ag1-Ab1和Ag2-Ab2的结合物，再将两种结合物按1∶1混合，此时Ag1-Ab1结合物中Ab1的半数IgGFc段与Ag2-Ab2结合物中Ag2的Fc受体结合，形成Ag1-Ab1-Ag2-Ab2的结合物，使半数Ag1被Ab1连接到Ag2，此时加入金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，借助SPA的IgGFc受体，分别连接Ag1-Ab1中未被结合的IgGFc和Ag2-Ab2中未被结合的IgGFc，从而在SPA、Ab1和Ab2的作用下，特异性、有比例地拉近骨髓瘤细胞和B细胞的距离，在刀豆蛋白A、IFN-γ和低浓度PEG的进一步作用下，易于胞膜的接触和融合。本专利技术发现SPA表达IgGFc受体、能结合IgGFc段，半数以上的B细胞也表达IgGFc受体、也能结合IgGFc段，IFN-γ能活化IgGFc受体、促进细胞融合，刀豆蛋白A能抑制细胞运动、促进细胞凝集和延长存活时间，据此设计预融合剂，处理待融合细胞，经SPA介导和双抗体捕获，使待融合的B细胞和骨髓瘤细胞按比例地特异结合，形成B细胞-抗B细胞抗体-SPA-抗骨髓瘤细胞抗体-骨髓瘤细胞的结合物，拉近细胞距离，易于胞膜接触，进而在特定浓度的IFN-γ、刀豆蛋白A和因低浓度而低毒性的融合剂(PEG)的作用下，使被融合细胞特异性融合，减少了无效融合，增加了B细胞和骨髓瘤细胞的有效融合和传代细胞的成活率。具体实施方式图1是本专利技术的SPA介导双抗体捕获助融示意图。图2是本专利技术的细胞融合图。在图1中，1表示具有IgGFc受体的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，2表示编号为6和7的待融合细胞的单克隆抗体，3表示编号为4和5的待融合细胞的单克隆抗体，在单克隆抗体[2]与编号为6和7的待融合细胞结合、单克隆抗体[3]与编号为4和5的待融合细胞结合后，再经SPA的连接，使编号为4、5、6和7的细胞均有利于在PEG的作用下发生融合。在图2中，在单克隆抗体和/或SPA的助融下，经HAT筛选2周，在倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交瘤细胞克隆。下面结合图1和图2，对本专利技术的实施方案作具体的描述。1、实验试剂(1)预融合剂：①基础液：在DMEM培养基中配入浓度为4.6μg/LIFN-γ、2.5μg/ml刀豆蛋白A；②甲液：在基础液中配入与被融合B细胞等效价的抗体(B细胞∶抗体＝1∶1)；③乙液：在基础液中配入与被融合骨髓瘤细胞等效价的抗体(骨髓瘤细胞∶抗体＝1∶1)；④丙液：在基础液中配入与被融合B细胞或骨髓瘤细胞或相应抗体等效价的SPA(B细胞或骨髓瘤细胞或相应抗体∶SPA＝1∶1)。其中IFN-γ能活化IgGFc受体、促细胞融合；刀豆蛋白A能抑制细胞运动、促进细胞凝集和延长存活时间；抗体能连接B细胞和骨髓瘤细胞、SPA能连接抗体的Fc段，形成B细胞-抗B细胞抗体-SPA-抗骨髓瘤细胞抗体-骨髓瘤细胞的结合物，拉近细胞距离，易于胞膜接触，进而在4.6μg/LIFN-γ、2.5μg/ml刀豆蛋白A和25％融合剂(PEG)的作用下，使被融合细胞特异性融合。(2)培养试剂：DMEM培养基、HAT选择培养基购自Sigma公司，优级胎牛血清(FBS)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂；2、细胞融合方法(1)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术，其特征在于，以抗骨髓瘤细胞抗体和抗B细胞抗体分别连接骨髓瘤细胞和B细胞，以SPA连接抗骨髓瘤细胞抗体和抗B细胞抗体，特异性、成比例地拉近被融合细胞的距离，进而在IFN‑γ、刀豆蛋白A和低浓度PEG的作用下，使胞膜接触和融合，提高了有效融合率和传代成功率。

【技术特征摘要】
1.一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术，其特征在于，以抗骨髓瘤细胞抗体和抗B细胞抗体分别连接骨髓瘤细胞和B细胞，以SPA连接抗骨髓瘤细胞抗体和抗B细胞抗体，特异性、成比例地拉近被融合细胞的距离，进而在IFN-γ、刀豆蛋白A和低浓度PEG的作用下，使胞膜接触和融合，提高了有效融合率和传代成功率。2.根据权利要求1所述的一种SPA介导双抗体捕获的杂交瘤技术，其特征在于，预融合剂包含(1)基础液：在DMEM培养基中配入浓度为4.6μg/LIFN-γ、2.5μg/ml刀豆蛋白A；(2)甲液：在基础液中配入与B细胞等效价的抗B细胞抗体；(3)乙液：在基础液中配...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，李兰娟，温馨，应俊，毛愉婵，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江,33